[发明专利]一种抗凝溶栓双功能融合蛋白的亲和层析复性方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药领域，特别是涉及一种抗凝溶栓双功能融合蛋白——水蛭素12肽-瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的亲和层析复性方法。

背景技术

本发明中的复性对象为水蛭素12肽-瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)，该融合蛋白是通过一个(Gly)₃柔性肽基团将重组水蛭素III的C末端12肽与rPA基因融合而成的一种同时具有抗凝溶栓双功能的全新蛋白(吴梧桐，余蓉，等溶栓和抗凝双功能融合蛋白、制备方法及其应，中国专利公开号CN1970574)。该蛋白通过目前最常用的表达系统-大肠杆菌进行表达(余蓉等抗凝、溶栓双功能水蛭素12肽-瑞替普酶融合蛋白的模拟、构建与表达，药物生物技术2007，14(3)：168-172)。虽然大肠杆菌表达蛋白具有快速、高效、价廉等优点。但外源蛋白在大肠杆菌中的大量表达，往往形成致密的包涵体。包涵体是无规则伸展肽链的聚集体，没有生物活性，需要通过一定的方法对包涵体进行溶解后复性使其恢复生物活性，并进一步纯化得到纯品后才能进一步使用。

蛋白质的复性及纯化技术是生物制药下游技术中的一个重点和难点，其成本大约占整个生物制药开发成本的50～70％，是一个生物药品能否顺利上市的关键。理想的蛋白复性技术应具备以下几个特点：①活性蛋白质的回收率高；②正确复性的产物易与错误折叠的产物分离；③复性后蛋白终浓度较高；④复性方法适合工业化生产；⑤复性过程耗时少，成本低。目前，国内外生物制药工业上普遍使用的复性手段还是稀释、透析复性等常规复性方法。稀释复性法是将包涵体蛋白变性液用复性缓冲液直接或者分步稀释，从而达到复性的目的。该方法存在复性时间长，缓冲液用量大，复性率及复性蛋白终浓度低等缺点。这无疑增加了复性的成本。而透析法复性蛋白是将包涵体蛋白溶液盛入透析袋中，用不断更换复性透析缓冲液将透析袋中的变性液逐渐置换出来，从而达到复性的目的(梁兰，余蓉，邓璇，等透析法体外复性抗凝溶栓双功能HV12p-rPA融合蛋白，药物生物技术，2009，16(02)：140-143)。该法仍然存在操作繁琐，复性时间长，复性率及复性蛋白终浓度较低的缺点。自从1990年Creighton等人(US Pat：4977248)首次采用离子交换层析复性蛋白以来，层析复性蛋白技术在蛋白质复性过程中的应用已取得了令人瞩目的成果。这种方法通过层析介质的介入，阻隔了蛋白质分子之间的相互作用，降低了聚集体的形成。蛋白质层析复性可在高蛋白质浓度下操作，适用于大规模生产，同时还能够纯化目标蛋白，具有双重作用。目前主要的层析复性技术有凝胶过滤层析法，离子交换层析法，疏水层析法，亲和层析法以及固定化分子伴侣、脂质体层析法等。不同层析复性方法有各自的优缺点及适用范围。当然对于某种蛋白往往需要通过实验条件优化(比如引入脲梯度，pH梯度及添加一些蛋白折叠辅助剂等)确定最适合该蛋白层析复性的方法。