[发明专利]木瓜蛋白酶抗原表位、抗木瓜蛋白酶抗体及其用途

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和免疫学领域。具体地，涉及一种木瓜蛋白酶抗原表位、抗木瓜蛋白酶抗体。本发明还涉及分别含有所述抗原表位或抗体的组合物、以及所述抗体在检测木瓜蛋白酶中的用途。

背景技术

木瓜蛋白酶(papain)(酶分类号EC：3.4.2 2)属于半胱氨酸蛋白酶(Cysteine proteases，CPs)，也是重要的蛋白水解酶。木瓜蛋白酶广泛存在于各种生物体内，在人类、狗、牛、小鼠、大鼠、斑马鱼、果蝇、蚊子、线虫、拟南芥和水稻中具有保守的结构(SEQ ID NO：1)。

研究发现，木瓜蛋白酶通常以酶原的形式存在于细胞之中，通过分子内或分子间蛋白水解而被激活，通过其活性中心半胱氨酸残基的巯基基团作为亲核试剂催化多肽链内部的α-肽键的水解，作用于蛋白质中L-精氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸和L-瓜氨酸残基羧基参与形成的肽键，能切开蛋白质分子内部肽键，生成分子量较小的多肽，属于肽链内切酶(Structure-function relationships in class CA1 cysteine peptidase propeptides，2003，Bernd Wiederanders，Institute of Biochemistry，Vol.50，No.3/2003，691 713)。

在水稻中，木瓜蛋白酶由位于第7号染色体上的基因Os07g0480900(GenBank中的ID号为NP_001059639.1)编码，编码框长1131bp(SEQ ID NO：2)，编码的木瓜蛋白酶(SEQ ID NO：3)具有376个氨基酸。

然而，迄今为止，在水稻生长发育过程中表达的木瓜蛋白酶基因的功能研究目前并不清楚。并且在现有技术中，通常制备的多克隆抗体特异性不高，用于检测目标物质会存在准确性不足的问题。另一方面，如果用木瓜蛋白酶制备抗原的话，无论是从重组表达还是化学合成，全长的氨基酸序列有376个氨基酸，蛋白质空间结构的重建是一个很困难的工作，再现与生物体内相同的空间构象仍然是现阶段蛋白质学研究的难点。一般来说抗原表位合成简易，准确性高，成本低廉，空间构象容易再现，因此有必要开发一种具有代表木瓜蛋白酶本身的抗原表位(antigenic determinant，AD)(又称抗原决定簇，是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团)来代替全长蛋白。

尽管目前已经有用于预测抗原表位的软件，例如BEPITOPE软件，但是预测得到的抗原表位中会有30％左右的非有效抗原表位，即不能特异性地代表抗原的抗原表位，或者不能引发免疫应答(Chang HT，Liu CH，Pai TW.Estimation and extraction of B-cell linear epitopes predicted by mathematical morphology approaches.J MolRecognit.2008 Nov-Dec；21(6)：431-41)。

发明内容

为了解决上述问题，本发明人在通过BEPITOPE软件预测得到多个抗原表位序列的基础上，进行了大量的实验和不懈的努力，结果发现在预测的32个抗原表位中有一个抗原表位序列HGVTPFSDLTREE(SEQ ID NO：4)是最有效的抗原表位，并且其具有良好的抗原特异性，并且制备了能与该蛋白酶特异免疫结合的抗体，该抗体具有足够的灵敏性和准确性。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种木瓜蛋白酶抗原表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

在本发明的一个实施方案中，为了增加与载体的交联性，在上述抗原表位的C末端添加了一个半胱氨酸(半胱氨酸提供二硫键与载体交联)，得到序列为HGVTPFSDLTREEC(SEQ ID NO：5)的抗原表位。

半胱氨酸也可以加在多肽的N末端，得到序列为CHGVTPFSDLTREE(SEQ ID NO：6)的抗原表位。

末端加1个半胱氨酸就可以了。如果在同一端加多个半胱氨酸，导致成本上升，并且二硫键密度太大，而实际上也不需要这么多二硫键。另外不宜在N末端和C末端都加半胱氨酸，因为一个抗原表位和一个载体结合，如果在两端分别加1个半胱氨酸，半胱氨酸与载体结合后，抗原表位少了游离端，反而不利于产生抗体。

本发明的抗原表位可以通过常规的肽合成技术化学合成得到，也可以在适当的宿主中表达得到；优选的是化学合成。