[发明专利]一种靶向治疗实体瘤的双歧杆菌pBES-tk重组载体及其用途

权利要求书

1.一种靶向治疗实体瘤的双歧杆菌pBES-tk重组载体，其特征在于：采用序列表中的SEQ ID №：1做为表达载体；所述靶向治疗实体瘤的双歧杆菌pBES-tk重组载体具有序列表中的SEQ ID №：2所表示的tk基因序列。

2.一种靶向治疗实体瘤的双歧杆菌pBES-tk重组载体的用途，其特征在于：用于靶向治疗实体瘤。

3.权利要求1所述靶向治疗实体瘤的双歧杆菌pBES-tk重组载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

第一步，先用基因合成方法合成GenBank号为AB032875的HSV-1tk基因，其序列特征为SEQ ID №：2；在其5-端添加BamHI酶切位点，3’端添加SalI酶切位点，然后将合成的tk基因片段克隆到pGH克隆载体中，测序检测正确后备用，命名为pGH-tk；

第二步，将pGH-tk和pBES质粒分别转化大肠杆菌DH5α，37℃培养10小时后纯化质粒，将纯化的pGH-tk和pBES质粒分别用BamHI和SalI双酶切，电泳分离后用凝胶纯化试剂盒(北京鼎国生物生产)分离纯化tk基因片段和载体pBES片段，用连接试剂盒(大连宝生物生产)在25℃连接30min，转化大肠杆菌DH5α，37℃培养过夜后挑取阳性克隆，扩大培养后纯化质粒，PCR和酶切鉴定正确后，命名为pBES-tk，-80℃保存备用，其序列特征为SEQ ID №：3；

第三步，a)将双歧杆菌培养至对数生长期即OD₆₀₀为0.6-0.7时，经去离子水配制的灭菌10％甘油洗涤处理后，以双歧杆菌为受体菌，用电转化法将纯化的pBES-tk质粒载体转化到受体菌中；转化条件为：15KV、200Ω、25μF；所述的双歧杆菌为受体菌，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC No：M203050的两歧双歧杆菌SHQ006；

b)再将转化处理后的双歧杆菌先在无抗菌素的MRS液体培养基中复苏60-120min，然后在含50μg/ml卡那霉素的MRS固体培养基上培养，选择抗性菌落，从而获得转tk基因的双歧杆菌，PCR和SDS-PAGE鉴定后的阳性克隆即为双歧杆菌pBES-tk重组载体的种子菌。