[发明专利]一种干扰素发酵液的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制品领域，具体的说是提供一种干扰素发酵液的制备方法。

背景技术

干扰素(inter2ference，IFN)是一类多功能细胞因子，它是由培养的细胞或动物体受到适宜的刺激时所产生的一种微量的、具有高度生物学活性的非特异性抗病毒物质。英国科学家Aliek等(1957)利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感病毒干扰现象时，从中获得了一种高活性多功能的糖蛋白，该蛋白能够抑制流感病毒在绒毛尿囊膜细胞中的繁殖，他们称其为干扰素(interferon，IFN)。Lamp son等(1963)纯化了干扰素，证明其是分子质量为20～34ku的蛋白质。近年来，干扰素一直是病毒学、细胞学、分子生物学、临床医学、免疫学、肿瘤学等相关领域的研究热点。

为了实现稳定的工业化发酵生产工艺，获得高产量高效价的工程菌体，设计适宜工程菌的培养基及发酵工艺是一项非常重要的工作。目前，对工程菌的发酵培养通常采用的是分批式培养方法。这种培养方式的培养初期，培养基中的营养物质过高会抑制工程菌的生长，培养的中后期，又因营养物的消耗而降低培养效率，且单批产量和表达IFN活性不是很高。为解决这个问题，对发酵工艺进行了改进，采用了反馈式流加培养。连续或间断测定限制性营养物质的浓度，并以此为目标来调解流加速率或流加液中营养物质浓度等。利用DO值及测定糖(碳源)来调控流加速度及量。

发明内容

本发明的目的是提供一种干扰素发酵液的制备方法。

本发明的技术方案概述如下：

(1)用YPD液体培养基为种子培养基，28～30℃有氧条件下培养毕赤酵母菌20～24h，成为一级种子；

(2)将一级种子液接种在YPD液体培养基二级种子培养基中培养，28～30℃有氧条件下培养毕赤酵母菌20～24h，成为二级种子；

(3)发酵罐实消，进行发酵扩大培养：首先将发酵罐的PH电极和溶氧电极进行标定，然后加入发酵培养基、甘油，同时在高压灭菌前还需要将蠕动泵调节为手动方式，流加氨水，调pH至5.0，最后121℃30min高压灭菌。灭菌结束后，等培养基温度降至28℃时，用种子流加管接种，发酵培养基、甘油、种子的添加比例为50∶3∶5，必须确保无菌操作，同时记录发酵罐参数。在28～30℃有氧条件下，采用流加补料发酵方式培养90～120h。在发酵过程中，当培养至30h(A值达到72～90)时，工程菌便进入加速生长阶段，此时需要由蠕动泵来补加培养液，通过DO值控制流加速度。当DO迅速上升时，准备流加甲醇；发酵液PH调节通过自动流加氨水；消泡剂同样自动补料。培养至30h时每隔5h抽样一次，培养至80h后间隔2h抽样一次，测湿重、A值及干扰素效价。

(4)发酵结束后，将发酵液经5000rpm 15min离心，收集上清液。上清液即为重组酵母菌经过诱导表达的干扰素发酵液，然后将发酵液用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液进行脱盐、浓缩，并用0.22μm的微孔滤膜无菌过滤处理，即可得到干扰素原液；菌体沉淀在干燥箱中40℃烘干成干粉。所得干粉以1∶5比例拌料使用。

所述的步骤(1)中种子培养时间为优选24h，培养温度28℃。

所述的步骤(2)中种子培养时间为优选24h，培养温度28℃。

所述的步骤(3)中所述的发酵培养时间最优为110h

本发明的有益效果是：

本发明的方法能改善固体发酵难于分离菌体及其代谢物的难题，使重组酵母菌及其代谢物被充分利用。采用流加式发酵方式使产菌量大大提高，利于工业化大量产生。因为该方法在菌体进入减速期前，新的营养物质不断补充，使得工程菌自始至终处于最优环境。这样延迟了稳定期，也就延长了对数期。所以用本发明的方法制备的干扰素发酵液，它表达的IFN的活性和纯度均比较高；菌体饲料添加剂应用于畜禽类时，可不使用抗生素和激素，并能促进畜禽类的生长。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1：干扰素发酵液的制备方法，包括下述步骤：

(1)用YPD液体培养基为种子培养基，28～30℃有氧条件下培养毕赤酵母菌20～24h，成为一级种子；

(2)将一级种子液接种在YPD液体培养基二级种子培养基中培养，28～30℃有氧条件下培养毕赤酵母菌20～24h，成为二级种子；