[发明专利]一种具有免疫活性的浒苔多糖及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及是医药生物技术，更详细地讲是关于浒苔等天然海藻提炼的一种具有免疫活性的浒苔多糖及其制备方法。

背景技术

众所周知，浒苔是一种大型绿藻，为近海滩涂中的天然野生绿藻，其自然繁殖能力特别强，产量巨大。我国海域特别是东海海域的绿藻主要以浒苔为主，其资源十分丰富，仅福建沿海每年天然产量(鲜重)达10万吨以上。近几年黄海海域的浒苔，大面积暴发，严重的影响了水体美观，污染海域环境。通常，浒苔作为垃圾丢弃，造成了环境污染，增加了处理成本，浪费了优质资源。因此，针对浒苔的研究开发是目前治理环境污染，优化资源利用的迫切需要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能消除上述缺点，具有方法简单、性能稳定、成本低廉、药用价值大，集降低胆固醇与提高免疫力为一体等特点的一种具有免疫活性的浒苔多糖及其制备方法。尤其是采用提取、脱蛋白、纯化的制备方法，以及科学的试验手段，首创性的研究获得浒苔多糖及其提炼方法，开创了治理浒苔的新方法和途径。它有效地开发了浒苔的药用价值和用途，治理了环境污染，降低了清理成本，提高了社会和经济效益，是理想的浒苔治理和综合利用的专用制备技术。

本发明的一种具有免疫活性的浒苔多糖是指多糖HT-II，其特征为白色絮状物，易溶于水和二甲基亚砜，相对分子量为96kDa，主要由葡萄糖和甘露糖组成，其组成比为：鼠李糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖＝36∶20∶6∶28。

本发明的一种具有免疫活性的浒苔多糖的制备方法，即多糖HT-II的提取纯化方法如下：

1、提取：从青岛海域采取缘管浒苔做样品，浒苔样品用自来水冲洗，自然风干后取100g，打碎，以浒苔渣与水的质量比为1∶30加入蒸馏水，95℃提取2h，抽滤，滤渣再以1∶15的蒸馏水重复提取两次。合并滤液，旋转蒸发浓缩至液体微黏，加入3倍体积的95％乙醇，4℃静置过夜。9000rpm离心，沉淀依次用85％、95％、无水乙醇及乙醚脱水，冷冻干燥得粗多糖。

2、脱蛋白：将粗多糖配成5％的糖溶液，用木瓜蛋白酶，按酶与粗多糖质量比为1∶50取蛋白酶加入至糖液中，边加边搅拌，50℃保温6h，9000rpm离心去除沉淀，上清液按糖液总体积的1/4加入Sevage试剂(正丁醇∶氯仿＝1∶4)，摇床充分震荡30min，静置，离心，取上清重复操作，直至无游离蛋白为止。

3、纯化：将粗多糖溶于pH7.4磷酸缓冲液中，上DEAE-Sephadex A-50层析柱(40×2.5cm)进行初步分离。室温下，以上限为0.5mol/L NaCl磷酸缓冲液进行梯度洗脱，流速24ml/h，自动部分收集洗脱液，每10min收集1管(每管约4ml)。采用苯酚-硫酸显色法，于490nm处测定吸光值，检测多糖含量。合并峰位洗脱液，透析后减压浓缩，冷冻干燥。获得的样品再由Sephadex G-100层析柱(100×2cm)进一步纯化，洗脱液为0.05mol/L NH₄AC溶液，流速为8ml/h，以苯酚-硫酸法跟踪检测。合并峰部的洗脱液，透析后浓缩冻干得纯化的浒苔多糖HT-II。采用紫外分光光度法，在260nm、280nm处检测样品的吸光值，确定其纯度。

本发明针对缘管浒苔的多糖进行分离提取，其制备方法为：打碎→90℃水提→过滤→合并提取液→浓缩→乙醇沉淀→去除蛋白→分离纯化→冷冻干燥→多糖纯品。经体外细胞活性检测，该多糖单独或协同ConA能够显著促进小鼠脾淋巴细胞增殖，同时提高细胞白介素II(IL-2)的分泌，可作为提高机体免疫力的食品添加剂。

结合多糖的组成分析，对本发明做进一步说明：

本发明的一种具有免疫活性的浒苔多糖，其多糖HT-II的分子量与单糖组成分析方法及结果：

1、采用高效凝胶渗透色谱法(HP-GPC)测定南极菌NJ-B3胞外多糖分子量。

分析条件：TSK-GEL G2000PW，3007.5mmID色谱柱；流动相0.1mol/LNa₂SO₄溶液，流速10ml/min；柱温60℃，进样量2μl，示差折光检测器检测。以标准Dextran T系列葡聚糖作标准曲线，计算分子量。

分析结果表明HT-II多糖的相对分子量为96kDa。