[发明专利]应用生物反应器工业化生产猪蓝耳病疫苗的方法

说明书

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种应用生物反应器工业化生产猪蓝耳病疫苗的方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome，PRRS)，又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起猪的一种高度接触性传染病，对养猪业危害很大。目前PRRS在国内愈演愈烈，直接和间接地造成了2006年流行我国大部分省份的所谓“猪无名高热病”，即高致病性猪蓝耳病，导致1000万～3000万头生猪死亡。我国已将高致病性猪蓝耳病列为一类传染病，疫苗免疫是目前防制该病的最根本有效措施。

目前猪蓝耳病疫苗的生产是采用传统的转瓶工艺，即猪蓝耳病病毒接种已形成单层的细胞，培养后一次性收获病毒液。但是每个转瓶均是独立的细胞培养单元，每瓶细胞的质量、病毒产量和滴度都不同，导致疫苗批间差异大，而且操作劳动强度大，生产效率低，隐性污染引起的高内毒素等缺点，已经越来越不适应当前疫苗大规模生产的要求。

专利公开号为CN101612395 A的专利申请，公开了一种应用生物反应器培养敏感细胞生产猪蓝耳病疫苗的方法，所用的生物反应器为搅拌式生物反应器、气升式生物反应、Wave生物反应器和中空纤维反应器；培养的方式是通过向生物反应器内接种种子细胞，并培养到一定的密度后，接种病毒，收获病毒液。但是利用Cell Lift型生物反应器，采用生物反应器间逐级放大的倒罐式操作技术，进行细胞的高密度培养以制备疫苗，未见报道。

发明内容

本发明的目的为了克服猪蓝耳病疫苗现有生产工艺的缺陷，提供了一种应用生物反应器工业化生产猪蓝耳病疫苗的方法，其优点是设备占地面积小、生产规模大；培养速度快、生产效率高；生产机械化，易于自动控制；培养设备密闭，不易污染；副产物少，疫苗的副反应小；生产的病毒液效价高，与传统的转瓶工艺相比，收获的病毒液滴度提高了0.5～1.5个LogTCID₅₀/ml，疫苗质量稳定。

本发明的技术方案为：

一种应用生物反应器工业化生产猪蓝耳病疫苗的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)用微载体培养制苗用细胞：将微载体和生物反应器经灭菌后，接种制苗用细胞，进行培养，待微载体上的细胞形成致密的单层，接种猪蓝耳病病毒，并继续培养，使病毒繁殖，所述的制苗用细胞为对猪蓝耳病病毒毒株敏感的细胞，且为Marc-145细胞和MA104细胞；(2)每天按时取样观察细胞病变情况，待细胞病变达到80％以上时，停止培养，收获病毒液制得猪蓝耳病活疫苗；或对收获的病毒液进行超滤浓缩和病毒灭活，通过柱层析方法纯化灭活的病毒，加入佐剂制备灭活疫苗。

所述的病毒的接种量为0.0001～0.1MOI。

所述的生物反应器设定参数为：pH 6.5～7.8、温度33～37℃、溶氧(DO)30～80％、搅拌速度30～100rpm。考虑到细胞培养的最适条件，优选的pH6.8～7.2、细胞培养阶段温度设定37℃，病毒培养阶段温度设定35℃、溶氧50％、搅拌速度30～100rpm。

所述的微载体为Cytodex系列微载体，微载体的使用密度为2～25g/L。

所述的生物反应器为搅拌式生物反应器。

所述的生物反应器容积为14～150L。制苗用细胞可采用14L～40L或14L～40L～150L逐级放大的培养模式，即通过胰酶将14L生物反应器培养的细胞消化下来，作为种子细胞接种到40L的生物反应器，再将40L的反应器内培养的细胞消化下来作为种子细胞接种到150L生物反应器，如此形成生物反应器之间的逐级放大培养过程，从而避免了单纯的用转瓶培养种子细胞而容易造成污染和增加劳动强度的缺陷；于40L或150L生物反应器培养猪蓝耳病病毒；或直接用14L、40L或150L的生物反应器培养病毒。

所述的生物反应器的培养采用批式、流加或灌注培养的方式，灌注的速率根据细胞的密度以每天0.5～4个工作体积。

猪蓝耳病病毒可以是制苗用的强毒株，用来制备灭活苗；也可以是制苗用弱毒株，制备弱毒活疫苗。

本发明采用生物反应器微载体培养技术进行细胞的高密度培养，生产猪蓝耳病疫苗，与传统的转瓶生产工艺相比，自动化控制程度高，生产可实时监控；节省人力，降低成本；生产用地少，规模易于扩大；生产的病毒滴度高，批间差异小，产品质量稳定，副反应小。

附图说明

图1为本发明的工艺流程图。

图2a为细胞接种后6h的微载体细胞图片。

图2b为细胞接种后5d的微载体细胞图片。