[发明专利]木糖异构酶基因的功能及其应用

说明书

技术领域：

本发明涉及拟南芥木糖异构酶基因转化木糖为木酮糖的功能，本发明还涉及含该基因的重组质粒及工程菌株，以及用该工程菌通过发酵含有木糖的培养基制备乙醇和其他发酵产物的应用。

背景技术：

尽管人们已知，来自植物的木质纤维素原料是地球上最丰富的可再生资源，可以大量获得。木质纤维素材料的可发酵糖主要为葡萄糖和木糖，分别占木质纤维素的40％和25％。但是，大部分能够进行乙醇发酵的酵母如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)不能够以木糖作为碳源。此外，还不知晓哪些微生物能够以高乙醇产量和高乙醇生产率的方式地将木糖发酵为乙醇。为了能够从木质素纤维素水解产物中商业化地生产乙醇，需要具有这两种特性的微生物。因此，本发明的目的在于提供能够利用木糖作为碳源进行乙醇发酵的酵母。

木糖异构酶(D-xylose isomerase，XI)催化五碳糖D-木糖转化为D-木酮糖，广泛存在于细菌、少部分真菌中。酿酒酵母具有木酮糖代谢的完整酶系，木酮糖进入磷酸戊糖途径，发酵生成乙醇。如果酿酒酵母能够高效的把木糖异构化成木酮糖，就可以利用木糖作为碳源进行乙醇发酵。

曾有人分别克隆表达了多种来源的木糖异构酶基因，如Escherichia coli，Bacillussubtilis，Thormotoga species，Thermus species等等。但迄今为止只有少数几种且多为嗜热细菌的木糖异构酶基因在乙醇生产传统菌株酿酒酵母中得到活性表达，而且在30℃左右的乙醇发酵温度下普遍由于活性太低而成为木糖代谢途径的限速步骤，因此寻找新的可在酿酒酵母里高效表达的木糖异构酶十分必要。

因此，发现新的可在酿酒酵母里高效表达的木糖异构酶，提供能够转化木糖生成木酮糖的酵母工程菌，很有必要。

拟南芥木糖异构酶基因(GenBankNO.835871)是通过全基因组测序和序列比对发现的。现有技术的文献仅在转录水平上证实了其存在，其所具有何种功能，以及可利用该基因做何种用途的研发，尚未见到有文献报道。

发明内容

本发明的目的是筛选出一种新的木糖异构酶基因，并将该基因导入酿酒酵母，使所得到的酵母遗传工程菌获得将木糖转化为木酮糖的能力。

本发明人首次发现拟南芥木糖异构酶基因(GenBank NO.835871)其编码的木糖异构酶在宿主细胞中表达后，赋予宿主细胞将木糖转化为木酮糖的能力。

本发明构建了具有上述木糖异构酶基因的重组质粒，并将该质粒导入了酿酒酵母中，获得了一种新的酵母工程菌。经实验证实，原来不具备转化木糖为木酮糖的能力的酿酒酵母赋予了该转化能力。

本发明进行了如下工作：

1.提取拟南芥mRNA，反转录生成cDNA，用保守引物克隆得木糖异构酶基因，其大小为1434bp；

2.将上述基因片段连接到具有高效表达活性的pYES2质粒载体中，构建具有完整木糖异构酶基因的重组质粒pYES-AXI；

3.将含木糖异构酶基因的重组质粒pYES-AXI通过电击转化方法导入不具将木糖转化为木酮糖的能力的酿酒酵母种，获得能够将木糖转化为木酮糖的遗传工程酵母菌株。(详见实施例4、5)

本发明发现了一种新的木糖异构酶基因，导入该基因的酵母遗传工程菌株能够获得将木糖转化为木酮糖的能力。

具体实施方式

以下实施例中所举的质粒、菌株只是用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。实际上，用本发明发现的基因和方法，本领域技术人员可以得到其它多种具有将木糖转化为木酮糖能力的遗传工程菌株，均不能脱离本发明的精神和思路。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

试验材料和试剂

1、菌株及载体：酿酒酵母表达载体pYES2购自Invitrogen公司，酿酒酵母菌株CEN.PK113-5D(表型为：MatAura3-52)及大肠杆菌DH5a由所在实验室保存。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶及连接酶购自NEB公司，其它试剂如未作具体说明都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。

(2)酵母培养基YPD(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖，平板添加2％琼脂)