[发明专利]一种基于荧光淬灭解除的DNA点突变检测方法

权利要求书

1.一种基于荧光淬灭解除的DNA点突变检测方法，其特征在于，步骤如下：

步骤1，提取待测样品的总基因组DNA；

步骤2，确定待测基因点突变位点，在所述位点的上游和下游区域分别选择一段序列设计正向和反向PCR引物，使其中一侧引物3’端的最后一个碱基正好在要检测的点突变的位置，并使这一碱基与这一位置的正常序列一致或相匹配；在所述引物3’端上标记淬灭荧光基团，在靠近所述引物3’端的碱基上标记报告荧光基团；

步骤3，加入具有3’~5’DNA外切酶活性的高保真DNA聚合酶，用所述正向和反向引物对待测DNA样品进行PCR扩增；并以已知正常的DNA样品作为对照；

步骤4，检测报告荧光基团发射波长的荧光；若检测到所述报告荧光基团的发射波长的荧光，则所述待测DNA中存在点突变；若检测不到所述报告荧光基团的发射波长的荧光，则所述待测DNA中不存在点突变。

2.根据全力要求1所述的检测方法，其特征在于，在所要检测的点突变位置的上游区域选择一段序列作为PCR的正向引物，使这一引物为18~32碱基长度；在所要检测的DNA变异碱基下游区域选择一段序列并以该序列的互补序列作为反向引物，使反向引物序列长度为18~32碱基；使PCR扩增的片段长80~180碱基。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，使反向引物3’端的最后一个碱基正好在所要检测的DNA变异碱基的位置且与所要检测的DNA变异碱基的位置的正常序列相匹配，并将反向引物靠近3’末端的一个碱基标记为报告荧光基团，将反向引物 3’末端最后一个碱基的3’碳原子标记一个淬灭荧光基团。

4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，使正向引物3’端的最后一个碱基正好在所述要检测的DNA变异碱基的位置且与所述要检测的DNA变异碱基的位置的正常序列相一致，并将正向引物靠近3’末端的一个碱基标记为报告荧光基团，将正向引物 3’末端最后一个碱基的3’碳原子标记一个淬灭荧光基团。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述具有3’~5’DNA外切酶活性的高保真DNA聚合酶为Vent DNA 聚合酶。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，用实时定量PCR仪进行PCR反应。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测DNA为人类基因组DNA，所述标准非甲基化DNA与标准甲基化DNA为于待测DNA相匹配的、已确定的纯的非甲基化人类基因组DNA和已确定的纯的甲基化人类基因组DNA。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述待测DNA样品为人类正常细胞DNA、癌细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、血细胞DNA、血清DNA、体液DNA或排泄物DNA的样品。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，

所述癌细胞为肺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、淋巴癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、肾癌细胞或胰腺癌细胞；

所述肿瘤组织为肺癌组织、胃癌组织、结肠癌组织、直肠癌组织、肝癌组织、乳腺癌组织、淋巴癌组织、膀胱癌组织、卵巢癌组织、肾癌组织或胰腺癌组织；

所述体液包括血液、脑脊髓液、胃液及各种消化液、精液、唾液、泪液、汗液、尿液、阴道分泌液。