[发明专利]家兔须癣毛癣菌鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，主要涉及聚合酶链反应试验中的引物在检测、鉴定须癣毛癣菌中的用途。使用这些引物能够检测家兔皮肤常发皮肤癣菌病的动态变化，并为家兔皮肤癣菌病诊断、治疗和兔场癣菌病净化奠定理论基础，并提供技术性指导。

背景技术

随着广谱抗生素、皮质类固醇、免疫抑制剂和介入治疗等的普遍应用，以及饲养宠物和旅游活动的普及，一些通常对人和动物无害的真菌在机体免疫力减弱时侵入体内，引起条件致病性真菌病和系统性真菌感染的现象日益多见。

家兔的皮肤真菌病是一种发病率高、传染性强、难治愈的人畜共患传染病。在家畜中主要感染兔、犬、猫，主要侵害家兔皮毛，出现皮屑、结痂、脱毛、渗出、毛囊炎及痒感等症状，不仅影响家兔生长发育，降低饲料报酬率和抵抗力，而且严重影响家兔的皮毛质量及易继发其他疾病导致死亡，给养兔业带来巨大经济损失。另外，本病还可感染人，常造成人的体癣、头癣和手癣，极大地影响了人们的身体健康。家兔皮肤真菌病病原有须癣毛癣菌，即石膏样毛癣菌，絮状表皮癣菌，石膏样小孢子菌，黄癣菌(许兰氏原型)及念珠菌属的热带念珠菌等，其中以须癣毛癣菌最常见，从生长形态上I型，III型，V型，给鉴定带来一定的难度。

多年来，传统的鉴别菌种的方法主要依靠真菌培养物的菌落形态及真菌菌丝的显微镜观察及一些生理、生化、免疫学方法。镜检虽然快速、经济，但缺乏种特异性，敏感性低。体外培养消耗时间较长，一般需要10-15天，并且易受外界因素的影响发生表型特征的改变，需要多年的实践经验和技术。近年来，分子生物学技术以其敏感度高、快速、简便的优点运用到真菌鉴定中，它不仅能检测出活的致病菌，而且也能检测出死亡的和难以培养的真菌。另外，因病原体的基因型比形态特征更具特异性及精确性，不会受外界影响因素的变化而改变。

目前，针对皮肤真菌的治疗，已开发了很多新的药物，由于许多新的广谱药物有各自不同的抗菌谱，有些新的唑类药物甚至在亲缘关系相近的某些皮肤癣菌中仍呈现不同的最小抑菌浓度。另外，由于生态环境的不同，不同菌株都处于一个动态的改变过程中，其治疗方案就必须针对特定病原菌，根据病原学，有针对性选择抗真菌药物。

鉴于以上原因，非常有必要建立一个快速、简便的鉴定方法，能够在家兔皮癣菌在兔场流行之前采取有效措施进行防控，在引进种兔时进行皮肤癣菌病的快速检验、检疫，在兔场皮癣菌净化提供有效监测手段。

在疾病诊断方法，研究人员已经使用以聚合酶链反应(PCR)为基础的技术，并成功检测了受感染动物病原体。在家兔皮肤癣菌病诊断方面，有基于病原菌核糖体RNA基因区的ITS，设计引物，使用PCR技术和测序分析技术加以鉴别、诊断，有利用随机引物进行皮肤真菌基因组DNA扩增，进行多态性分析，达到鉴别诊断的目的，但是这些方法在临床实践中，成本高，实际操作和分析手段对操作人员要求较高，在临床上难以推广应用。

本发明的DNA序列来自病原菌的基因组未知功能序列，在GenBank序列比对中未发现与之同源性高的序列，设计的特异性引物，通过PCR可有效区别于其它病原菌，从而达到鉴别、鉴定的目的，本发明鉴定、检测方法操作简单，快速，特异性强。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一组检验家兔须癣毛癣菌的核苷酸序列。

本发明要解决的另一个技术问题是提供家兔须癣毛癣菌鉴定方法。

为实现以上目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明提供了鉴定须癣毛癣菌的特异性引物序列和扩增产物的序列。特异性引物对包括正向引物序列SEQ ID NO：1所述的碱基序列，反向引物序列SEQ ID NO：2，以及SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的互补序列，扩增产物序列的互补序列。

本发明还提供了一种用于鉴定家兔须癣毛癣菌的方法，该方法包括以下步骤：

(1)提取待测癣菌DNA，或者提取待检测家兔皮肤毛样DNA；

(2)特异性引物对：人工合成正向引物序列SEQ ID NO：1和反向引物序列SEQ ID NO：2。

(3)以(1)的DNA为模板，使用特异性引物进行PCR扩增；

PCR 25μL反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，2.5mmol/LdNTP 1μL，25mmol/L Mg²⁺1μL，Taq DNA聚合酶1.5U，10mmol/L引物各1μL，模板(基因组DNA)1μL，不足部分用双蒸水补足。