[发明专利]大豆叶片胚性愈伤组织和体细胞胚诱导方法

说明书

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，是以大豆叶片为外植体诱导体细胞胚发生和植株再生的方法。 

背景技术

大豆是世界性的重要粮油作物，也是主要的植物蛋白和牲畜家禽的重要饲料来源之一。去年，全球大豆种植面积超过1亿公顷，年产量超过2亿吨。因此培育出重要目标性状突出的优良大豆新品种将会获得巨大的经济效益。然而，效率低、周期长、性状改良幅度不大的常规杂交育种很难满足生产上对大豆新品种的实际需求，而运用高效转基因技术结合常规育种程序有可能解决上述问题和达到预期目标。 

优良的大豆再生体系是实现大豆高效遗传转化的前提和必要条件。大豆的组织培养研究始于20世纪60年代，但当时总的看来，各种外植体的组织培养与再生植株都十分困难，直到进入80年代中后期，大豆组织培养工作才有了突破性的进展。目前，大豆从器官发生和胚胎发生两种途径均能植株再生。大豆器官发生途径所用的外植体种类较多，有下胚轴，子叶，子叶节、未成熟子叶、茎尖等。其中，子叶节不定芽器官发生再生体系是农杆菌介导的大豆遗传转化中最常用的受体系统。大豆胚胎发生常用的外植体主要有未成熟子叶、未成熟胚和胚轴等，所用的外植体均为未成熟组织。 

大豆遗传转化方法主要有农杆菌介导法、基因枪法、PEG转化法、原生质体法、电击法等，还有不通过组织培养过程的子房微注射法、花粉管导入法等。但目前应用最广泛且比较成熟的大豆遗传转化方法主要有根癌农杆菌介导的子叶节方法和基因枪介导的体细胞胚方法两种。根癌农杆菌介导的子叶节法具有操作简单、转化的基因拷贝数少、取材不受限制等优点，但由此系统获得的转化植株嵌合体较多，增大了后期剔除的工作量。基因枪介导的体细胞胚法虽然不产生嵌合体问题，但转化效率低，且因转基因受体均为未成熟组织，具有外植体取材受时间和季节限制等缺点。 

综上所述，尽管人们对大豆组织培养再生体系和相应的遗传转化方面做了大量的研究工作，但大豆转基因研究进展还是非常缓慢，仍然存在大豆植株再生难、转化不易重复、存在嵌合体、转化效率低等诸多问题。因此，研究大豆组培再生体系和相应的转化系统对于大幅度提高其遗传转化效率具有重要意义。 

发明内容

本发明提供一种以大豆成熟种子萌发形成的叶片为外植体诱导大豆体细胞胚植株再生的方法。本发明的目的是：1)该再生体系所用的外植体叶片取自于大豆成熟种子萌发的材料，从而避免了现有大豆体细胞胚发生再生体系因采用未成熟组织为外植体而取材受时间和季节限制的问题；2)提供一种简便有效的大豆胚性愈伤组织诱导方法；3)提供一种简便有效的大豆体细胞胚诱导方法。 

本发明大豆叶片体细胞胚诱导植株再生的方法是通过以下几个步骤进行的：1)大豆种子萌发1～11d，并分别制备外植体幼叶；2)将幼叶放在诱导培养基上诱导产生胚性愈伤组织；3)诱导体细胞胚发生。 

为了比较不同外植体对体细胞胚的诱导效果，通过对种子的不同萌发处理，制备了不同外植体幼叶。将大豆种子用75％乙醇表面消毒1min，再用0.1％升汞溶液消毒12min，用无菌水冲洗4次，然后放入无菌水于26℃暗中浸泡1d，或者直接接种于1/2MS[1/2MS无机盐类、B₅维生素、pH 5.8]或1/2MSB萌 发培养基[1/2MS无机盐类、B₅维生素、0.5mg/L 6-BAP、pH 5.8]上，并于26℃16/8h(光/暗)下，萌发7d获得幼苗，并从中切取真叶，同时把真叶的叶柄切去，便可获得外植体幼叶。