[发明专利]叶片特异性表达人工microRNA提高水稻对白叶枯病抗性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一条21nt水稻抗病相关DNA分子的设计、验证及应用。本发明人工设计了一条21nt的人工microRNA序列，并利用天然microRNA osa-MIR528前体作为骨架，构建了人工microRNA前体。在转基因水稻中，叶片特异性地表达这条人工microRNA的前体，可以增强转基因水稻对白叶枯病的抗性，同时不影响转基因水稻的育性等重要农艺性状。

背景技术

抗病、虫育种是农业生产上主要育种目标之一。在抗病、虫育种中，抗性基因资源是最重要的。因此，育种家和生物学家们在大量的栽培品种或野生品种中进行大规模的鉴定以获得抗性基因资源。水稻白叶枯病由白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.Oryzae，Xoo)引起，是世界上对水稻危害最大的细菌性病害。幸运的是，由于生产上抗白叶枯病品种的应用使得这种水稻细菌性病害在生产生被有效控制。

目前在水稻中已鉴定出30多个抗白叶枯病菌主效基因，其中有5个是隐性的。xa13基因是近年来从水稻籼稻品种IRBB13克隆的一种特殊的水稻隐性抗白叶枯病基因(Chu et al.2006)。xa13与其显性等位基因Xa13在基因的编码区没有差异，但是xa13启动子部分的序列变异导致了其在水稻叶片中的表达显著下降，从而使得水稻植株获得了对白叶枯病菌菌株PXO99特异性的抗性。组成型抑制xa13等位显性基因Xa13的表达可以提高水稻对菌株PXO99抗性，但是同时会导致花粉育性显著下降，表明该基因不仅控制水稻的抗病性还与水稻的育性有关(Bart et al.2006；Chu et al.2006)。

在育种上特别是杂交育种，由于隐性抗性基因的使用并不方便(需要同时改良杂交品种的两个亲本)，因此育种家更重视显性抗白叶枯基因如Xa21或Xa23等的应用。由于致病菌的进化，一种抗病基因在生产上使用几年或者十几年后会逐步丧失其抗性。隐性抗病基因xa13的功能与抗病和育性有关，和以往发现的抗病基因有较大差异，其抗病机理与其他抗病基因应有较大的差异，是对抗病基因资源的重要补充。因此人类在生产上与病原菌进行长期斗争的过程中，充分利用这些隐性抗性基因具有重要意义。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年来发现的一种RNA介导的基因沉默现象。利用RNAi技术特异性地沉默植物内源相关代谢途径上的关键基因来改良作物品质，已经取得了很多成功的例子。比如，提高小麦籽粒中直链淀粉含量(Regina et al.2006)；提高玉米赖氨酸和色氨酸含量(Huang et al.2006)；提高棉籽油中硬脂油和油酸含量(Liu et al.2002)，降低棉籽中棉酚的含量(Ganesan et al.)；提高油菜油酸含量，降低芥酸含量(Peng et al.2010)；提高番茄中类胡萝卜素和类黄酮含量(Davulurj et al.2005)，延长番茄成熟期(Xiong et al.2005)；降低木薯块茎氰苷含量(Jorgensen et al.2005)等等。由于RNAi导致基因沉默的分子机理是通过RNA介导的反式作用方式来实现的，因而利用RNAi机理改良的作物性状均为显性遗传。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，利用水稻和拟南芥来源的叶片特异性启动子，精确地抑制Xa13基因在叶片中的表达而不影响其在花药中发挥功能，既能提高转基因水稻对白叶枯病的抗性，又不影响其的育性。

本发明是这样实现的：

参考Chu等人(2006)发表的文献获得Xa13基因的基因序列号编号并在网上查到其序列。利用amiRNA设计软件(http://wmd3.weigelworld.org/cgi-bin/webapp.cgi？page＝Designer；project＝stdwmd)设计21nt的amiRNA序列。通过人工分析，挑选其中2条amiRNA序列命名为amiA和amiB，并设计引物，利用PCR的方法构建amiRNA的植物表达载体。由于Xa13的基因功能与水稻花粉发育相关，本发明使用叶片特异性表达启动子水稻的rbcS启动子(Osrbcsp)以及拟南芥rbcS1A启动子(Atrbcsp)驱动amiRNA前体的表达。通过农杆菌介导的遗传转化将amiRNA表达载体转化到水稻优良恢复系明恢63中。人工接种检测表明，转含amiB表达载体的水稻植株高抗白叶枯病菌菌株POX99，而转amiA表达载体的水稻植株抗性增强不明显。对这些转基因植株的育性进行考察发现，转基因水稻植株花粉发育正常，育性与野生型明恢63无显著差异。

本发明的优点在于：