[发明专利]多孔树脂珠粒及使用其制造核酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种多孔树脂珠粒。更说明地，本发明涉及含有第一芳族单乙烯基化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯腈-第二芳族单乙烯基化合物共聚物的多孔树脂珠粒。所述多孔树脂珠粒在合成核酸时特别有用。

背景技术

使用亚磷酰胺法的固相合成方法被广泛用于核酸如DNA寡核苷酸和RNA的化学合成。在所述方法中，例如，首先通过可切割的连接体如琥珀酰基，将成为待合成的核酸的3’-末端的核苷预先负载到固相合成载体上，并且将所述载体放入反应柱中且安置在自动核酸合成仪上。之后，例如，以下列根据所述自动核酸合成仪的合成程序的方式，将合成试剂注入所述反应柱中。(1)通过三氯乙酸/二氯甲烷溶液、二氯乙酸/甲苯溶液等对核苷5’-OH基进行脱保护，(2)通过核苷亚磷酰胺(核酸单体)/乙腈溶液和活化剂(四唑等)/乙腈溶液，使阿米迪特(amidite)与5’-OH基进行偶联反应；(3)通过乙酸酐/吡啶/甲基咪唑/THF等对未反应的5’-OH基进行封端，以及(4)通过碘/水/吡啶等对亚磷酸酯进行氧化。

通过重复所述合成循环，合成了具有预期序列的核酸。通过用氨、甲胺等对可切割的连接体进行水解，将最后合成的核酸从所述固相合成载体中切出(参见非专利文献1)。

作为在核酸合成中待使用的固相合成载体，迄今已使用CPG(可控孔度玻璃)、硅胶等无机粒子，但是近年来，已经开始使用能够增加每重量固相合成载体的合成核酸量的树脂珠粒，以便以合适的价格和大量来进行合成。作为这种树脂珠粒，例如可提及高交联且不溶胀的多孔聚苯乙烯珠粒(参见专利文献1)、低交联且溶胀的多孔聚苯乙烯珠粒(参见专利文献2)等。

然而，当将作为合成起点的核苷连接体的负载量增加至太高水平，以便进一步增加每重量固相合成载体的合成核酸量时，会造成阿米迪特的偶联效率变差且获得的核酸纯度显著降低的问题。例如，可商购的固相合成载体的核苷连接体负载量的上限迄今最多为约200μmol/g，所述负载量的核苷连接体能够以高纯度合成20个碱基的DNA寡核苷酸。

已通过使用丙烯腈抑制多孔树脂珠粒在各种有机溶剂中的溶胀比波动来进行尝试以改进核酸合成能力(参见专利文献3)。然而，尽管该文献中使用的多孔树脂珠粒在各种有机溶剂中多孔树脂珠粒的溶胀比波动小，但是对核酸合成能力还需要进一步的改进。

专利文献1：JP-A-3-68593

专利文献2：JP-A-2005-325272

专利文献3：JP-A-2008-74979

非专利文献1：核酸化学的当前规程(2000)，第3.6单元，未改性寡核苷酸的合成(Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry(2000)，UNIT 3.6 Synthesis of Unmodified Oligonucleotides)。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于以高合成量和高纯度来合成核酸的多孔树脂珠粒。

本发明人已首次出乎其意料地发现，在含有第一芳族单乙烯基化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯腈-第二芳族单乙烯基化合物共聚物的多孔树脂珠粒中，当在核酸合成中使用其中

(1)所述第二芳族单乙烯基化合物含有能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团，并且

(2)在乙腈中的溶胀体积为3至6ml/g，

的多孔树脂珠粒作为固相合成载体时，提高了获得的核酸合成量并提高了其纯度。

基于这些发现，本发明人已进一步进行深入研究，结果完成了本发明。

因此，本发明涉及下列多孔树脂珠粒，用于制造核酸的方法等。

(1)一种多孔树脂珠粒，所述多孔树脂珠粒包含第一芳族单乙烯基化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯腈-第二芳族单乙烯基化合物共聚物，其中所述第二芳族单乙烯基化合物含有能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团，并且其中所述多孔树脂珠粒在乙腈中具有3至6ml/g的溶胀体积。

(2)在(1)中所述的多孔树脂珠粒，其中所述能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团是选自氨基、氨烷基、羟基和羟烷基的基团。

(3)在(1)或(2)中所述的多孔树脂珠粒，其中源自所述(甲基)丙烯腈的结构单元的量为1至6mmol/g。

(4)在(1)至(3)中任一项所述的多孔树脂珠粒，其中基于单体的总量，所述二乙烯基化合物的量为2至10mol％。

(5)在(1)至(4)中任一项所述的多孔树脂珠粒，其中所述二乙烯基化合物是二乙烯基苯。