[发明专利]一种在油菜中获得人工小染色体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及将含有拟南芥端粒序列的pTFM5植物载体转化油菜，而在油菜中发生端粒介导的染色体的切割，进而获得油菜人工小染色体的一种方法。本发明还涉及对所获得的油菜中的小染色体进行检测的方法。本发明还涉及人工小染色体技术在油菜基因工程中的应用。 

背景技术

作物基因工程的广泛应用很大程度上降低了杂草和虫害的控制成本，同时减轻了除草剂，杀虫剂等农药对人类健康和环境的危害。然而，当今的基因工程技术也存在着许多局限性。例如，大多转基因技术是进行单性状基因的转入，而很难将控制多个性状的多个基因同时转入一种作物中，更无法将整个一条代谢途径的所有基因引入作物中，很难产生新的性状或新的代谢产物；外源基因在转入作物时，往往整合进内源基因而破坏内源基因功能；而转化的随机性使得转入的外源基因受到整合区域上游或下游调控元件的影响，很难进行操控。随着作物基因工程和人工染色体技术的发展，出现了小染色体技术，小染色体可以作为外源基因表达的独立平台，不会随机整合入常染色体，不会破坏内源基因的功能。通过位点特异重组系统，多个基因可以以有序的方式添加到小染色体上。以这种方式转入的基因存在于确定的位置。相比于随机整合，基因的表达更易调控[1]。因此，小染色体的出现提供了解决常规转基因技术存在的问题的有效途径。 

端粒位于染色体的末端，其保护了染色体稳定性[2]。它由串联排列的高度保守核苷酸序列和结合蛋白质组成。许多多细胞真核生物的端粒序列都已被克隆[3-5]。在真核生物中，端粒基序通常是5到8碱基长，而且高度保守。在拟南芥等大多数植物种类中，保守序列是TTTAGGG[3]。这些重复序列与蛋白质结合形成了具有保护作用的核酸-蛋白复合物。而且端粒重复序列可以与端粒酶结合，以进行染色体的末端复制，避免染色体的长 度由于细胞分裂而逐渐变短[6]。 

通过将克隆到的人端粒序列转化到哺乳动物细胞中验证端粒功能，发现新转入的端粒序列能够在染色体上产生新的端粒[7，8]。断裂的染色体可以通过生殖系传递而具有遗传性[7，9]。应用端粒介导的染色体切割技术在动物中产生小染色体，已经发展成一种动物人工染色体平台：含有端粒的动物载体靶入到体细胞染色体上，由于端粒的存在而介导染色体在端粒处发生切割，不含着丝粒的染色体片段在细胞分裂时丢失，而含有着丝粒的染色体片段则形成了独立的小染色体[9，10]。 

植物人工染色体的研究起步较晚，目前植物人工染色体的构建主要基于两种策略，第一种是在细胞内或者细胞外将着丝粒DNA、端粒DNA以及复制原点装配在一起，从而构建了植物人工染色体。目前只在玉米中成功开展了此类研究工作。Carlson等在体外构建了一些包含着丝粒序列和筛选标记的人工染色体，并将其转入玉米中，描述了这些人工染色体在玉米中的遗传[11]。第二种是将外源性端粒DNA整合入植物染色体，可将该染色体截断，同时在断端产生新的端粒。目前也仅是在玉米中发展了这种端粒介导的染色体切割体系，产生了玉米人工小染色体。Yu W等构建了含有2.6kb的拟南芥端粒序列重复和标记基因的植物载体pWY86，该载体还包括Pnos-FRT-FLP-Tnos基因表达盒，可用于FRT/FLP位点特异重组系统的操作。将pWY86转入玉米中，可以在整合位点发生染色体的切割[12]。通过大规模的遗传转化，在发生切割的A染色体和B染色体中均可获得携带转基因的小染色体。 

油菜是世界上重要的油料经济作物。将控制多个性状的多个基因转入油菜中为培育油菜高产抗性品种提供了一个新途径。目前，油菜人工染色体的研究尚未见报道。 

发明内容

本发明的一个目的是提供选择带有端粒重复序列的一种植物载体pTFM5，其用于油菜转化时可以在油菜中发生端粒介导的染色体的切割，进而获得油菜小染色体和带有小染色体的转基因油菜工程株。 

本发明的又一个目的是提供一种在油菜中获得人工小染色体的方法， 该方法包括选择pTFM5载体转化植物组织，将转化的植物组织培育成植株。所述的转化可通过农杆菌介导法进行。 

本发明的又一个目的是提供一种对所获得的油菜中的小染色体进行检测的方法。可以利用荧光原位杂交技术和Southern杂交技术检测转化植株的染色体切割。 

本发明的又一个目的是提供带有油菜人工小染色体的转基因油菜工程株，可以利用其进行进一步的转多基因操作，获得具有特殊性状或者可以合成特殊代谢产物，但并不影响常染色体传递以及植物正常性状的转基因油菜新种质。 

更具体地，本发明提供以下各项：