[发明专利]一种犊牛体外胚胎培养液

说明书

技术领域

本发明涉及一种培养液，具体地说，涉及一种犊牛体外胚胎培养液。

背景技术

和多数哺乳动物一样，牛的卵泡发生于胎儿时期，在怀孕后期胎儿和出生后几天的幼牛卵巢上都可以检测到有腔卵泡的存在，2月龄时数目达到50个左右，明显高于成年母牛。因此，充分利用犊牛卵母细胞生产效率高于成年母牛数倍这一生理特点，发挥良种犊牛最大遗传潜力成为奶牛繁殖新技术领域中研究的热点之一。

以犊牛为供体不仅可为胚胎体外生产提供大量的卵母细胞资源，满足卵母细胞冷冻、胚胎分割、克隆和转基因等科研、生产的需求；而且还可以显著缩短世代间隔，加快育种进程；充分发掘优良遗传性状母牛的繁殖潜能；加快优良牛群的扩群速度。若结合性控精液进行研究，还可进一步加快育种进展，提高牛群的遗传改良速度与生产效率，为奶牛育种提供丰富的遗传资源。

目前，影响犊牛体外胚胎生产技术的因素主要包括：激素超排处理方法、体外培养体系、犊牛月龄、犊牛个体差异。其中体外培养体系是影响犊牛体外胚胎生产技术的重要因素。

Revel等对3月龄犊牛卵母细胞的体外成熟、体外受精和体外培养进行了研究，结果发现，受精率和卵裂率与成年牛差异不显著，但是，体外培养7d后囊胚率显著低于成年牛，同样妊娠率也显著低于成年牛，这说明犊牛卵母细胞中控制囊胚形成的一些关键因子可能尚未完全出现或表达。有学者指出，这可能是因为犊牛卵母细胞胞质存在缺陷造成的。

谷胱甘肽(GSH)作为细胞内一种主要的自由硫醇基团，在细胞增殖、氨基酸运输、蛋白质和DNA的合成、硫化物和其它化学物质分解以及保护细胞对抗氧化过程中具有重要的生物学功能。谷胱甘肽在卵母细胞成熟的过程中大量合成积累，成熟后胚胎不再具有合成谷胱甘肽的能力。成熟过程中卵母细胞内GSH水平的升高为下一步的受精以及胚胎分裂提供更加适宜的细胞内环境，在体外成熟体系中添加半胱胺，β-巯基乙醇，半胱氨酸，胱氨酸都能刺激牛卵母细胞合成GSH，但是只发现半胱胺能够增强胚胎的发育能力。

半胱胺(Cysteamine，NH₂CH₂CH₂SH，相对分子量为77.15)，又称β一巯基乙胺(简称CS)，相当于半胱氨酸的脱羧产物，是辅酶A分子的组成成分及动物体内的生物活性物质，在体内具有重要的生理作用。

在体外培养液中添加含有硫醇基团的半胱胺能够增强卵母细胞对半胱氨酸的吸收，促进GSH的合成，增强卵母细胞对抗活性氧的能力，促进卵母细胞胞质的成熟。因此，在体外成熟液中添加半胱胺能够提高卵裂率和囊胚率。但是半胱胺的添加要适量，否则会降低囊胚发育率。

发明内容

本发明的目的是提供一种犊牛体外胚胎培养液。

为了实现本发明目的，本发明的一种犊牛体外胚胎培养液，所述培养液中含有半胱胺。其中，半胱胺的含量为50μM-100μM，优选的半胱胺含量为100μM。

前述的成熟培养液中还包括：TCM199+10mM HEPES+5％FBS+0.5μg/ml FSH+5μg/ml LH+1μg/ml E₂+27.5μg/ml丙酮酸钠+100IU/ml青链霉素。

生产前述犊牛体外胚胎的方法包括高效的卵母细胞体外成熟、体外受精、胚胎体外培养技术等。具体方法为：

1)犊牛激素超排：选用9-12周龄犊牛，经阴道埋植羊用CIDR，分别在第5d和第6d注射FSH，第7d手术法采卵，利用9号针头采集卵巢上直径为3～6mm的卵泡液。

2)犊牛卵母细胞体外成熟：将步骤1)中得到的卵母细胞加入到成熟培养液中，在38.5℃，5％CO₂，饱和湿度的条件下培养22-24h。

3)将得到的犊牛成熟卵母细胞进行体外受精。

4)受精卵在体外发育成胚胎。

前述的方法，步骤1)中在第5d注射FSH，剂量为40mg-45mg，间隔12h注射30mg-35mg，第6d注射FSH，剂量为30mg-35mg，间隔12h再注射30mg-35mg。

前述的方法，步骤2)中成熟培养液的成分：TCM199+10mMHEPES+5％FBS+0.5μg/ml FSH+5μg/ml LH+1μg/ml E₂+27.5μg/ml丙酮酸钠+100IU/ml青链霉素+100μM半胱胺。

前述的方法，步骤3)中受精时间为8h。