[发明专利]一种固相DNA芯片杂交液及杂交方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种固相DNA芯片杂交液及简易杂交方法。

背景技术

随着人类基因组(测序)计划(Human genome project)的逐步实施以及分子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的动植物、微生物基因组序列得以测定，基因序列数据正在以前所未有的速度迅速增长。基因芯片(又称DNA芯片、生物芯片)技术就是顺应这一科学发展要求的产物，它的出现为解决此类问题提供了光辉的前景。基因芯片技术已经越来越多的应用于基因诊断、分析、以及基因治疗等方面。该技术系指将大量(通常每平方厘米点阵密度高于400)探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。目前已有多种方法可以将寡核苷酸或短肽固定到固相支持物上。这些方法总体上有两种，即合成点样与原位合成(in situ synthesis)两种。支持物有多种如玻璃片、硅片等但需经特殊处理。作点样用的支持物为使其表面带上正电荷以吸附带负电荷的探针分子，通常需包被以氨基硅烷或多聚赖氨酸等。作原位合成的支持物在聚合反应前要先使其表面衍生出羟基或氨基(视所要固定的分子为核酸或寡肽而定)并与保护基建立共价连接。也有一些探针被固定到一些微球上，并且在溶液中实现芯片杂交，这种芯片一般叫做液相芯片。

基因芯片主要包括四个基本要点：芯片方阵的构建、样品的制备、生物分子反应和信号的检测。其中生物分子反应，芯片上的生物分子之间的反应是芯片检测的关键一步。杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。通过选择合适的反应条件使生物分子间反应处于最佳状况中(如杂交温度，杂交时间，杂交液的组成成分等)，减少生物分子之间的错配比率。

寡核苷酸探针与靶分子之间进行生物分子反应一般需要用到杂交液，.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，Ed.2^nd，1989，vol.1-3，据文献报道探针的长度，杂交温度，以及其他一些因素都会影响到杂交效果的好坏。如果杂交过程在低于DNA分子的熔解温度(Tm值)的5-10℃进行时，能够有效的减少错配或非Watson/Crick碱基配对，加大Watson/Crick碱基配对的正确率。

杂交液通常情况下都包括一种盐(含单价阳离子的盐)，金属离子螯合剂如EDTA、以及防止非特异性杂交的封闭剂。含单价阳离子的盐，如SSPE、SSC能使杂交缓冲液的PH维持在6.8-8.5之间。SDS为表面活性剂，鲑鱼精DNA和脱脂奶粉均可去除背景信号。一般情况下杂交缓冲液包含6×SSPE(0.9M NaCl，60mM磷酸盐(pH 7.4)；6mM EDTA)；或者6×SSC(0.9M NaCl，90mM柠檬酸钠(pH 7.0))，0.5％w/v sodium dodecyl sulfate(SDS)；100μg/ml鲑鱼精DNA，0.1％的脱脂奶粉，去除背景信号。

基因芯片杂交温度和时间取决于探针的组成(探针的长度及探针中所包含不同碱基的含量)以及目标分子的复杂度，杂交温度一般在20℃到70℃之间，杂交时间一般在2h到2d之间。低的杂交温度在20℃到50℃之间(一般情况下在37℃-45℃范围内)，高的杂交温度在50℃到70℃之间(一般情况下在60℃-65℃范围内)。高的杂交温度可以提高Watson/Crick碱基的配对几率，低的杂交温度只能通过延长杂交时间来提高Watson/Crick碱基配对几率。低的杂交温度杂交时一般需要过夜杂交或者更长的时间(8h-24h)。杂交温度低经常会出现杂交信号不好，背景信号高，杂交结果有斑点等，这就影响了芯片的品质。这个问题需要通过提高杂交温度和缩短杂交时间来解决。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够以较低成本，简单、快速的实现固相DNA芯片杂交的杂交液及采用此杂交液进行杂交的方法。

为了达到上述目的，本发明人经过大量不同类型芯片的杂交试验得到杂交液成分及采用此杂交液进行杂交的优选方法。本发明的技术方案如下：

一种固相DNA芯片杂交液，其特征在于它是由NaCl，Na-MES，EDTA，SDS原料组成；其NaCl 717mM，Na-MES 400mM，EDTA 100μM，SDS 0.2％(w/v)。