[发明专利]一种电化学发光检测孔雀石绿的方法

说明书

技术领域

本发明属于一种高灵敏电化学发光检测领域，具体涉及一种电化学发光检测孔雀石绿(无色孔雀石绿)的方法。

技术背景

孔雀石绿是有毒的三苯甲烷类化学物，既是染料，也是杀菌剂。孔雀石绿可致癌，很多国家已经禁用。孔雀石绿价格低廉，治疗鱼病效果好，尤其是对治疗水霉病和小瓜虫病有特效，而在其病防领域没有合适的替代药物出现，因此，仍有渔民在防治鱼类感染真菌时使用，也有运输商用作消毒，以延长鱼类在长途贩运中的存活时间等，加上使用者对孔雀石绿的危害认识不足，所以导致孔雀石绿禁而不止。研究表明，孔雀石绿的代谢物无色孔雀石绿在鱼体内存留的时间更长。因此，开发一种简单、高效的孔雀石绿(无色孔雀石绿)的检测方法具有十分重要的意义。

目前孔雀石绿(无色孔雀石绿)的检测方法主要以理化检测法和免疫学检测法为主(刘海新，张农，钱卓真，福建水产，2007(1)，42～45)。理化检测法包括以下几种：高效液相色谱法(HPLC)可以检测生物体内及其他复杂基质中的孔雀石绿和无色孔雀石绿(如饲料原料、化工原料等)，此方法的特点是灵敏度较高。高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS-MS)是近年来发展起来的新的检测技术，该方法兼具定性功能、灵敏度高，但仪器价格昂贵。还有薄层色谱法(侯云龙，中国刑警学院，1997(4)，19～20)，普通分光光度法(Safarik I.，Kova M.，Water Research，2000，36，196～200)等。薄层色谱法虽然具有简便快速的特点，但是不能同时检测孔雀石绿的代谢物无色孔雀石绿。分光光度法：普通分光光度法检测限较高，灵敏度较低，准确性较差，也不能用于代谢物无色孔雀石绿的检测，而且仅仅局限于水样的检测，尚未见该方法在复杂样品基质中的应用，仅可用于孔雀石绿原料药等的测定。免疫学检测法是指酶联免疫法(ELISA)，可分为：间接竞争抑制法、抗体/抗原包被直接竞争法和夹心法。采用酶联免疫试剂盒检测水产品中孔雀石绿的特点是：检测速度快，2～3小时就可检测一批样品；灵敏度高，该方法特别适合大批量样品的筛选。虽然ELISA法的抗原和抗体结合有较强的选择性，但水产品的种类繁多，基质复杂，检测结果的假阳性几率高。因此，用该方法检出的阳性样还需用高压液相色谱法或液相色谱质谱联用法进行定量和确证。

三联吡啶钌Ru(bpy)₃²⁺电化学发光(Electrochemiluminescence，简称ECL)具有原位响应、检测灵敏度高、线性范围宽和仪器简单等优点，在药物分析、氨基酸分析、DNA探针分析、酶生物传感器领域得到了广泛应用。但目前还没有任何将电化学发光用于孔雀石绿(无色孔雀石绿)检测的相关报道。我们采用的电化学发光法检测孔雀石绿(无色孔雀石绿)能达到更低的检测限和更宽的检测范围，操作比较简单，检测速度快。

发明内容

本发明的目的是针对现有的孔雀石绿检测方法，提出一种全新的检测限更低、检测线性范围更宽、灵敏度更高的电化学发光检测孔雀石绿(无色孔雀石绿)的方法。

本发明的原理是：本发明使用联吡啶钌类化合物作为发光物质，孔雀石绿(无色孔雀石绿)作为共反应物之一，同时也是被检测物。将它们分别溶于磷酸或硼酸缓冲溶液中，用电化学方法在0-1.8V电位范围内对其进行扫描；同时利用光检测器采集产生的光信号，经数据处理得到检测结果。由于联吡啶钌类化合物具有很高的发光效率，即使被测物孔雀石绿(无色孔雀石绿)的浓度很低，该方法仍可检测到明显电化学发光响应，并且孔雀石绿(无色孔雀石绿)加入前后体系电化学发光强度的变化与体系中孔雀石绿(无色孔雀石绿)浓度的对数值呈现良好的线性关系，通过计算可以确定体系中孔雀石绿(无色孔雀石绿)的含量。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：一种电化学发光检测孔雀石绿(无色孔雀石绿)的方法，步骤如下：

(1)根据孔雀石绿(无色孔雀石绿)样品浓度，将10^-7～10^-1mol/L的联吡啶钌以及待测的孔雀石绿(无色孔雀石绿)样品分别加入到pH值为3-11的0.1M的磷酸盐或硼酸盐缓冲溶液中；

(2)在任意一款电化学工作站上，对步骤(1)配置的溶液进行扫描；扫描电位范围0-1.8V；

(3)所述的联吡啶钌包括单核三联吡啶钌、以及通过不同长度碳链连接的双核三联吡啶钌，其代表性结构式如下：

三联吡啶钌

双核三联吡啶钌