[发明专利]胃癌靶向DEC1基因的siRNAs表达载体的构建、筛选及其用途

权利要求书

1.靶向DEC1基因的siRNAs表达载体，其特征是，以pGreenPuro shRNA Cloning andExpression vector为载体，针对人分化型胚胎软骨发育基因1(DEC1)编码区上、下游的两段序列，在较高表达DEC1的胃癌细胞系BGC823中发挥RNA干扰作用；这两段DEC1特异性RNA干涉靶序列分别为：①5’-CATTGCCCTGCAGAGTGGTTTACAA-3’，起始于661位；②5’-CCAAGCTTAGCTTCTCAAAGGCCTAA-3’，起始于2476位，由以下方法制得：

(1)RNA干涉靶序列的选择及插入序列的设计与合成

选择DEC1基因编码区的两段序列①5’-CATTGCCCTGCAGAGTGGTTTACAA-3’、②5’-CCAAGCTTAGCTTCTCAAAGGCCTAA-3’，设计并分别体外合成两对互补的寡核苷酸序列，序列如下：

①DEC1寡核苷酸序列1：

正义链：

5’-GATCCCATTGCCCTGCAGAGTGGTTTACAACTTCCTGTCAGATTGTAAACCACTCTGCAGGGCAATGTTTTTG-3’

反义链：

5’-AATTCAAAAACATTGCCCTGCAGAGTGGTTTACAATCTGACAGGAAGTTGTAAACCACTCTGCAGGGCAATGG-3’

②DEC1寡核苷酸序列2：

正义链：

5’-GATCCCCAAGCTTAGCTTCTCAAAGGCCTAACTTCCTGTCAGATTAGGCCTTTGAGAAGCTAAGCTTGGTTTTTG-3’

反义链：

5’-AATTCAAAAAAATCCGGAAACTCTTCGATTCGAACCTCTGACAGGAAGTTAGGCCTTTGAGAAGCTAAGCTTGGG-3’

(2)将步骤(1)合成的两对寡核苷酸等量混匀，95℃作用4分钟后慢慢冷却至室温，然后将结合的双链寡核苷酸与线性化的pGreenPuro shRNA Cloning and Expression vector质粒载体连接，最后转化到JM109大肠杆菌，经氨苄青霉素筛选，挑选单个菌落大量培养，用质粒提取试剂盒提取纯化质粒DNA；

(3)质粒的鉴定

将步骤(2)提取的质粒DNA琼脂糖凝胶电泳，应用引物Forward sequencing primer H和Reverse sequencing primerH进行PCR鉴定，紫外分光光度计分析测定质粒DNA的浓度和纯度，并进行插入片断测序，以确定合成的寡核苷酸是否已正确转入pGreenPuro shRNACloning and Expression vector质粒中。

2.权利要求1的靶向DEC1基因的siRNAs表达载体在制备治疗表达DEC1的胃癌的基因药物中的应用。