[发明专利]荠菜冷诱导COR15a基因及其在改良植物的抗寒性中的应用

权利要求书

1.一种分离的具有低温诱导表达特性的荠菜冷诱导基因CbCOR15a，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中碱基第1-674位的序列所示。

2.一种包含荠菜冷诱导基因CbCOR15a的重组质粒，其特征在于，它含有权利要求1所述的核苷酸序列。

3.一种荠菜冷诱导蛋白CbCOR15a，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。

4.按照权利要求3所述的荠菜冷诱导蛋白CbCOR，其特征在于，所述的荠菜冷诱导蛋白CbCOR15a由137个氨基酸构成的蛋白质。

5.如权利要求1所述的荠菜冷诱导基因CbCOR15a的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）材料的培养，将荠菜种子经过消毒后，播种于含MS₀培养基的培养罐内；

（2）提取冷驯化后的荠菜中RNA，经1%非变性琼脂糖凝胶电泳，用260-280nm波长的紫外扫描来分析其质量；

（3）采用RACE方法克隆得到荠菜冷诱导基因CbCOR15a的全长序列，RACE采用的引物为5’CbCOR15a1：5'-CTCTCCTGCTTTACCCTCCGCGAA-3'，5’ CbCOR15a2：5'-TTCTTTTCCT TTCTCCTCCACATA-3'。

6.如权利要求2所述的包括荠菜冷诱导基因CbCOR15a的重组质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）根据如权利要求1所述的荠菜冷诱导基因CbCOR15a的核苷酸序列，设计一对能扩增出完整开放阅读框（ORF）的引物，在正向引物和反向引物上分别引入限制性酶切位点；

（2）将上述扩增得到的荠菜冷诱导基因CbCOR15a的ORF克隆到中间载体pMD18-T，进一步克隆到植物表达载体p1304上；

（3）将上述表达载体转入根癌农杆菌EHA105中，用于转化模式植物烟草。

7.如权利要求3所述的荠菜冷诱导蛋白CbCOR15a的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）构建原核表达载体pQE30-CbCOR，并转化大肠杆菌M15；

（2）荠菜冷诱导蛋白CbCOR15a的诱导表达及SDS-PAGE检测；

（3）荠菜冷诱导蛋白CbCOR15a的纯化：先超声破碎，再煮沸，然后通过Ni亲和层析柱，最后PEG浓缩。

8.如权利要求2所述的包含荠菜冷诱导基因CbCOR15a的重组质粒在改良植物抗寒性与耐寒性中应用。

9.如权利要求8所述的荠菜冷诱导基因CbCOR15a在植物抗寒性与耐寒性中应用，其特征在于，所述植物为水稻、小麦、玉米、棉花、油菜或番茄。