[发明专利]逆向分化体细胞产生造血干细胞的培养液、方法及用途

权利要求书

1.一种用于逆向分化体细胞产生造血干细胞的培养液，其特征在于，所述培养液为在RPMI 1640培养基中添加以下成分：当归提取物10～100mg/ml、人参提取物10～100mg/ml、Rho激酶抑制剂Y-27632 5～30μM、干细胞因子5～30ng/ml、白细胞介素-3 5～30ng/ml、白细胞介素-6 5～30ng/ml、白细胞介素-11 5～30ng/ml；优选地，所述培养液中还包括水蛭提取物80～120mg/ml。

2.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述培养液为在RPMI1640培养基中添加以下成分：当归提取物50mg/ml、人参提取物50mg/ml、Rho激酶抑制剂Y-2763210μM、干细胞因子10ng/ml、白细胞介素-3 10ng/ml、白细胞介素-6 10ng/ml、白细胞介素-11 10ng/ml；优选地，所述培养液中还包括水蛭提取物100mg/ml。

3.权利要求1或2所述的培养液在逆向分化体细胞产生造血干细胞中的用途。

4.一种逆向分化体细胞产生造血干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求1或2所述的培养液培养体细胞，使其逆向分化产生造血干细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)用添加以下成分的RPMI 1640培养基培养体细胞48-72小时：当归提取物10～100mg/ml、人参提取物10～100mg/ml、Rho激酶抑制剂Y-276325～30μM、干细胞因子5～30ng/ml、白细胞介素-3 5～30ng/ml、白细胞介素-65～30ng/ml、白细胞介素-11 5～30ng/ml；

2)换用添加以下成分的RPMI 1640培养基培养6-9天：当归提取物10～100mg/ml、人参提取物10～100mg/ml、水蛭提取物80～120mg/ml、Rho激酶抑制剂Y-27632 5～30μM、干细胞因子5～30ng/ml、白细胞介素-3 5～30ng/ml、白细胞介素-6 5～30ng/ml、白细胞介素-11 5～30ng/ml；

优选地，所述步骤1)和2)的培养条件如下：5％CO₂和37℃。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括用DMEM培养液在逆向分化体细胞之前培养体细胞的步骤；优选地，所述培养条件为：细胞密度2-5x10⁶/ml，5％CO₂，37℃，培养24-48小时。

7.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括检测逆向分化体细胞产生的造血干细胞的步骤；优选地，所述检测方法为：以CD34、ABCG2和/或CD133作为特异细胞表型检测指标，采用流式细胞仪、细胞免疫荧光技术和/或蛋白印迹技术进行检测。

8.根据权利要求3至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括冷冻保存逆向分化体细胞产生的造血干细胞的步骤；优选地，所述冷冻保存方法为：将造血干细胞以1x10¹⁰/ml的细胞密度与二甲基亚砜混合，以10％二甲基亚砜和10％低分子右旋糖酐浓度降温至-80℃，然后转移到-186℃液氮中深低温保存。

9.根据权利要求3至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述体细胞选自：血液单个核细胞、胎盘细胞、皮肤细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、成纤维细胞等。

10.权利要求3至9中任一项所述方法制备的造血干细胞或造血干细胞库。

11.权利要求10所述的造血干细胞作为种子细胞和再生修复细胞，在制备用于再生医学/修复医学领域的疾病和损伤；恶性血液病；抗衰老保健的药物中的用途；优选地，所述再生医学/修复医学领域的疾病和损伤选自：缺血性心脏病、糖尿病、脑出血、脑梗死、股骨头坏死、卵巢早衰、脑震荡、脑挫裂伤、大脑损伤、开放性颅脑损伤、肝硬化、纤维肝、脂肪肝、出血性坏死性胰腺炎、胰腺损伤、胰腺纤维化、各种肿瘤化疗后免疫功能减退综合症、放疗后免疫功能减退综合症的免疫功能重建、慢性肾上腺皮质功能减退症、腺垂体功能减退症、垂体前叶机能减退症、中枢性尿崩症，甲状腺切除术后甲状腺损伤、甲状腺功能减退症、甲状旁腺机能减退症和肾功能衰竭；所述恶性血液病选自白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤，先天性溶血性贫血、再生障碍性贫血和放射性疾病。