[发明专利]湿地嗜油假单胞菌株的基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种湿地嗜油假单胞菌株的基因及其应用。

背景技术

自然界中存在着一些可以在含有高浓度甚至是极端高浓度油的环境中正常生长的微生物。经过研究发现，这些微生物并非都可以应用于含高浓度石油烃废水、污泥的处理，只有对其经过严格的筛选和驯化后得到的嗜油菌株才有此作用。嗜油微生物的首选取样点就是所要处理的污染环境中，因为在油污染环境中存在着一定数量的微生物，这些微生物对受油污染环境有较好的适应能力。初筛选出的嗜油微生物经过驯化后，即可作为嗜油微生物菌株应用到油污染废水与污泥的处理实践中。黄浦江作为上海市水上运输的主干道，过往船只突发性污染泄漏事故的风险较高，溢油事件时有发生，使黄浦江-长江口附近湿地生态系统受到了一定程度的污染。湿地的微生物修复技术相比于土壤的微生物修复技术起步较晚，许多修复措施主要是借鉴土壤微生物修复措施。而湿地环境与土壤环境的风化过程、温度、可利用的氧浓度、可利用的营养基质浓度、pH以及盐度等环境因素的特点有所不同，因此探索适合于湿地油污环境的微生物修复技术就变得非常重要。

微生物的分类方法常用的有经典分类方法和分子生物学方法。经典分类方法主要指依据形态特征、培养特征及生理生化特征等分类方法。分子生物学分类法，又称分子分类方法，是指在分子水平上对生物个体的核酸及蛋白质进行研究，并据此对生物个体进行分类的方法。由于16S rDNA序列分析具有突出的作用，因此常被分子分类方法采用。目前，16S rDNA序列分析的方法主要有两种：一种是16S rDNA提纯后用反转录酶和保守引物进行测序，另一种是扩增16S rDNA基因对应的DNA序列，然后将PCR产物回收后直接测序。更进一步的可靠方法是扩增16S rDNA基因对应的DNA序列，将该序列做成感受态细胞，质粒扩增，然后对质粒进行测序。这是一种研究rDNA同源性最直接可靠的方法。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种湿地嗜油假单胞菌株的基因。

本发明的目的之二在于提供该基因的编码蛋白。

本发明的目之三在于提供该基因在降解废水、污泥中的油污中的应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种湿地嗜油假单胞菌株的基因，其特征在于该基因具有下列核苷酸序列之一：

1)具有SEQ ID NO：1所示的碱基序列；

2)与SEQ ID NO：1所限定的核酸序列具有95％以上的同源性，且编码相同生物学功能蛋白质的DNA序列。

一种上述的湿地嗜油假单胞菌株的基因编码的蛋白，其特征在于该蛋白具有下列氨基酸序列之一：

1)具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；

2)通过将SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而产生的衍生蛋白质的氨基酸序列，该衍生蛋白质与SEQ ID NO：2的蛋白具有相同的生物学功能。

一种重组载体，其特征在于该重组载体含有权利要求1所述的湿地嗜油假单胞菌株的基因。

一种宿主细胞，其特征在于该宿主细胞含有权利要求3所述的重组载体。

上述的湿地嗜油假单胞菌株的基因在降解高浓度柴油污水中的应用。

一种克隆上述的湿地嗜油假单胞菌株的基因的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

i.从油污湿地筛选的湿地嗜油假单胞菌株的菌落中提取该细菌的核16S rDNA基因；

ii.对提取出的16S rDNA基因进行PCR扩增，扩增条件为：98℃预变性5min，95℃变性35s，55℃退火35s，72℃延伸1min 30s，35个循环，72℃延伸8min，扩增的引物是：P1正向引物为：5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’，

P2反向引物为：5’GGTTACCTTGTTACGACTT 3’19bp；

iii.PCR产物的回收；

iv.对回收产物的片断TA克隆，具体。

质粒提取，得到湿地嗜油假单胞菌株的基因的全长1496个核苷酸全序列。

采用BLAST分析法，将16S rDNA全序列与GenBank数据库比较，该菌株与假单胞菌有很高的同源性。

从黄浦江-长江口岸边湿地油污土壤中筛选出嗜油微生物，结合这些微生物的最宜生长条件与特性，将其应用于柴油的降解并研究其降解特性。为降解高浓度柴油污水与污泥提供了有用的菌源和技术，具有较强的实际应用价值。可再进一步研究其应用于石油类污染的处理中。

附图说明

图1本发明的嗜油菌的生长曲线

图2本发明的嗜油菌的适宜生长温度