[发明专利]一种特异性识别激活Gαs蛋白单克隆抗体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物科学和药物研发领域。 

背景技术

G蛋白是细胞内主要的信号传导蛋白，G蛋白中Gα亚基的激活与否是细胞信号传导的一个标志，对于细胞迁移和分化起着关键的信号传导作用。鉴于其功能，该类蛋白成为细胞生物学和新药发现即药物筛选的一个主要研究目标，据统计大约有70％的药物是通过G蛋白途径发挥作用的，通过对G蛋白以及相关信号通道激活的检测是药物筛选的主要途径之一。 

G蛋白有两种构象：与GTP结合时的激活态和GDP结合时的钝化态。通常情况下，绝大多数G蛋白是与GDP结合的钝化型。与GDP结合的G蛋白能与各种各样的受体相互作用，这种相互作用增加了受体与配体的结合亲和力。一旦受体与配体结合，受体被激活，α亚基就与β和γ亚基分离，同时离开受体。由于解离下来的α亚基与GDP的结合亲和力下降，GDP就能够与游离在细胞内的GTP发生交换，产生与GTP结合的激活型的G蛋白。被激活的G蛋白就与效应蛋白相互作用，改变了第二信使的浓度，从而发生信号转导响应。如此这般，配体与受体短短几毫秒时间的接触可以延长为几十秒，乃至更长时间的反应，使输入的信号可以被大大地放大。 

Gαs是Gα家族中一种，其功能是通过激活，与效应蛋白相互作用，抑制腺苷酸环化酶，降低第二信使的浓度，同时还有更多的理化作用也在逐步揭示中。 

现有的所有针对Gαs蛋白的抗体都只仅仅能监测总的Gαs蛋白水平，无法分辨Gαs蛋白的激活状态。 

发明内容

本发明的目的是解决上述问题而提供了一种特异性识别激活Gαs蛋白 单克隆抗体及其制备方法，利用本发明的方法制备出的单克隆抗体可以特异性识别Gαs蛋白的激活状态。 

本发明所采用的技术方案是： 

一种特异性识别激活Gαs蛋白单克隆抗体，是由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏号为CCTCC C201093的杂交瘤产生的。 

一种权利要求1所述的特异性识别激活Gαs蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤： 

1)构建表达Gαs蛋白的表达质粒，表达Gαs蛋白； 

2)通过γ-s GTP激活Gαs蛋白； 

3)以此激活的Gαs蛋白作为抗原免疫可产生单克隆抗体的动物，完成免疫周期； 

4)融合脾细胞和S/P20细胞，通过激活的抗原筛选出表达特异性识别激活Gαs蛋白单克隆抗体的融合细胞株； 

5)以该细胞株的细胞通过可产生单克隆抗体的动物生产，而获得特异性识别激活Gαs蛋白鼠单克隆抗体。 

优选地，所述可产生单克隆抗体的动物为小鼠、大鼠和兔子。 

进一步地，所述可产生单克隆抗体的动物为小鼠或大鼠时，在步骤5)中以该细胞株的细胞通过小鼠或大鼠生产腹水，而获得特异性识别激活Gαs蛋白单克隆抗体。 

进一步地，所述可产生单克隆抗体的动物为兔子时，在步骤5)中以该细胞株的细胞通过兔子生产血清，而获得特异性识别激活Gαs蛋白单克隆抗体。 

本发明具有以下优点： 

本发明的特异性识别激活Gαs蛋白单克隆抗体，能特异性的识别激活Gαs蛋白，对于Gαs蛋白的激活理化变化研究可以从根本上予以揭示，对于利用Gαs蛋白途径进行细胞生物学研究和新药筛选研发起到了关键的作用。 

杂交瘤细胞株M08#15，于2010年9月10日在中国典型培养物保藏中心(中国武汉大学)，保藏号为CCTCC C201093。 

附图说明

图1为试验样品的免疫印染实验图谱； 

图2为试验样品中激活Gαs蛋白含量的标准曲线图。 

具体实施方式

实施例1 

利用免疫沉淀-免疫印迹结合法来证明本发明的单克隆抗体可以识别激活Gαs蛋白。 

首先需要制备试验样品，样品分为两种，贴壁细胞样品和悬浮细胞样品。 

1.贴壁细胞样品的制备 

(1)待细胞长到90％的汇合密度时，根据需要加入激活或抑制因子进行细胞刺激。 

(2)吸走培养基，并用预冷的PBS洗涤两次。 

(3)彻底吸走最后的PBS溶液，并添加预冷的1X的细胞裂解液(每100毫米的细胞培养板加入0.5毫升细胞裂解液)。 

(4)将细胞培养板放置于冰上10分钟。 

(5)用细胞刮片从细胞培养板上彻底的刮离细胞。 

(6)转移细胞裂解物到一个大小适合的管中，并放置于冰上。