[发明专利]胰高血糖素样多肽-1类似物及其制备方法与应用

权利要求书

1.胰高血糖素样多肽-1类似物，其特征在于：所述胰高血糖素样多肽-1类似物的氨基酸序列如下所示：

Xaa₅-Xaa₆-His-Xaa₈-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Xaa₃₄-Xaa₃₅-Arg-Xaa₃₇

或药物学可接受的盐；

其中：

Xaa₅是Pro，Gly，Ac，NH₂或者缺失；

Xaa₆是Pro，Ala，Ser或者缺失；

Xaa₈是-NH-CH(CH₃)-CH₂-；

Xaa₃₄是Lys或者Pro或者缺失；

Xaa₃₅是Gly或者Pro或者缺失；

Xaa₃₇是βAla，Met，homoserine，Gly，Asp，NH₂或者缺失；

但是，所述的胰高血糖素样多肽-1类似物不包括以下序列：

GLP-1(7-37)OH，GLP-1(7-36)NH₂，Gly⁸-GLP-1(7-37)OH，

Gly⁸-GLP-1(7-36)NH₂。

2.根据权利要求1所述的胰高血糖素样多肽-1类似物，其特征在于：所述类似物为通过连接Xaa₃₇和Xaa₅形成的环状肽。

3.根据权利要求1所述的胰高血糖素样多肽-1类似物，其特征在于：所述类似物为通过Cys⁵二硫键形成的二聚体肽。

4.根据权利要求1所述的胰高血糖素样多肽-1类似物，其特征在于：所述类似物为C-端酰胺化胰高血糖素样多肽-1类似物。

5.根据权利要求1所述的胰高血糖素样多肽-1类似物，其特征在于：所述胰高血糖素样多肽-1类似物是由天然氨基酸合成。

6.一种权利要求1所述的胰高血糖素样多肽-1类似物的制备方法，其特征在于：

(1)将编码如下胰高血糖素样多肽-1类似物的氨基酸序列的DNA构建于蛋白表达质粒pMFH；前述氨基酸序列为以下述公式重复连接，重复片段之间通过甲硫氨酸或Asp-Gly或Asp-Pro连结：--{GLP-1类似物}n--其中n＝1-6；

(2)表达；

(3)蛋白纯化，得到所述的胰高血糖素样多肽-1类似物。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：

所述蛋白纯化包括以下步骤：

A)将氨基乙酸硫酯或氨基丙酸硫酯在无水环境下连接到固相小珠表面；

B)重组融合载体pMFH的N终端设计有半胱氨酸，将含有重组胰高血糖素样多肽-1类似物的融合蛋白通过化学连接法共价连接到固相小珠的表面；

C)表达的融合蛋白通过Ni-NTA亲合色谱柱纯化，在洗脱液中，加入4％benzymercaptan，和4％thiophenol或者2％MESNA；

D)用化学水解液充分地洗涤固相小珠，化学水解液为：0.1摩尔浓度盐酸，6摩尔浓度盐酸胍；

E)以1∶200～400摩尔比加入溴化氰分解融合蛋白释放重组胰高血糖素样多肽-1类似物；收集合并含有多肽的洗出液，使用C18 Sep-Pak反相柱进行脱盐。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤A中，所述的固相小珠为Affi-Gel10胶凝体。

9.权利要求1所述的胰高血糖素样多肽-1类似物在制备用于治疗2型糖尿病的缓释药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述缓释药物的原型为：

蛋白载体-连结体-胰高血糖素样多肽-1类似物；

所述蛋白载体为人白蛋白；

所述连结体具有如下氨基酸序列：

Yaa1-Yaa2-Yaa3-Yaa4-Yaa5-Yaa6-Yaa7

其中：

Yaa1：Cys或缺失；

Yaa2：Phe或Leu或缺失；

Yaa3：Asn或Val或缺失；

Yaa4：Pro或缺失；

Yaa5：Arg或缺失；

Yaa6：Gly或Pro或Ala或缺失；

Yaa7：Ser或Pro或Ala或缺失。