[发明专利]小牛血去蛋白提取物的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域的血液制品，具体涉及一种小牛血去蛋白提取物的制备方法。

背景技术

小牛血去蛋白提取物注射液，曾用名：血活素注射液，系由新鲜小牛血或血清经去蛋白、浓缩、超滤或透析等工艺制得的含有无机物及小分子有机物的灭菌水溶液。本品可增强组织细胞对氧及葡萄糖摄取与利用，改善细胞乏氧状态和机体内环境，增加心、脑、肝等脏器的血流量，改善微循环。用于脑缺血、脑痴呆、脑外伤及大脑功能不全等脑细胞代谢障碍性疾病的治疗。

该注射液中的无机物包括钾、钠、钙、镁、铜、铁、锌等电解质和微量元素。这些无机离子能够调节细胞膜的通透性，控制、维持正常渗透压和酸碱平衡，帮助运输各种元素到全身，参与神经活动和肌肉收缩等；微量元素可以与有关药效成分协同配合，并通过配合、螯合反应而起到治疗疾病的作用。有机物包括氨基酸、小肽、核苷酸、嘌呤等，可进入组胞参与蛋白质的合成，细胞代谢，使人体获得正氮平衡，并生成酶类、激素、抗体、结构蛋白，促进组织愈合，恢复正常生理功能。

目前，已公开了一些有关小牛血去蛋白提取物的制备工艺，多数工艺采用乙醇沉淀、酶解等方法去除杂蛋白。也有用柱层析除杂的方法。

该注射液在临床使用中发生不良反应主要是因为杂蛋白未有效去除，有机物类物质如氨基酸、小肽、核苷酸、嘌呤等发生聚合为大分子物质而引起过敏反应。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能有效去除小牛血中杂蛋白的小牛血去蛋白提取物的制备方法，以解决现有技术的缺陷。

本发明的技术方案为：将小牛血进行低温冷冻、升温，再重复进行低温冷冻、升温后；再加入注射用水升温至75～85℃，保温25～40分钟后；过滤弃渣，再离心分离后取第一上清液；将第一上清液冷却至0-5℃，搅拌加入-10～-20℃的冷丙酮，在-20℃～5℃的低温环境下静置后，迅速离心，弃沉渣取第二上清液；减压真空浓缩第二上清液，得浓缩液；调节浓缩液的pH值3.5-4.5，75～85℃℃保温25～40分钟，冷却至室温离心分离，弃沉渣取第三上清液；调节第三上清液pH值7.5-8.5，75～85℃保温25～40分钟，冷却至室温离心分离，弃沉渣取第四上清液；调节第四上清液pH值6.5-7.5后，然后再分别利用50KD、10KD和5KD超滤膜逐级超滤澄清后得澄清液，得小牛血去蛋白提取物。

所述将小牛血进行低温冷冻、升温，再重复进行低温冷冻、升温是：将小牛血在≤-15℃的温度下存放不少于三天后；再将冷冻的小牛升温到35±2℃融化；待全部融化为液态无硬心时，再次小牛血在≤-15℃的温度下存放不少于三天后，再将冷冻的小牛升温融化，如此反复三次。

所述浓缩液的体积是所述小牛血体积的1/4～1/6。

将得到的小牛血去蛋白提取物中加注射用水调节至每毫升溶液中含小牛血去蛋白提取物总固体物为40mg；加入稳定剂。

本发明将小牛血采用低温反复冻融，能使细胞内外的有效物质充分释放，保证有效成分的充分提取；提取工艺中采用80℃，30分钟能使杂蛋白变性，同时能灭活病毒，再加上后续的超滤工艺，能充分保证牛源性病毒的灭活，保证制剂产品的安全性；本法采用丙酮和酸碱沉淀去除杂蛋白，较传统仅用乙醇沉淀法能更有效去除各类杂蛋白；先后通过50KD、10KD，5KD超滤膜多级超滤，既能保证杂蛋白的彻底去除，又能有效地控制高分子量物质，本发明制备的小牛血去蛋白提取物中的高分子物质，经检测少于0.3％，较“国家标准高分子物质不得过2.0％”的规定更为严格，能更好的保证产品质量，保证临床安全性；制剂配料过程中加入吐温-80作稳定剂，能有效得避免制剂在储存过程中有机物类氨基酸、小肽、核苷酸、嘌呤等聚合为大分子物质析出，影响制剂的澄明度，保证产品长时间储存过程的稳定，同时降低过敏反应发生率。

具体实施方式

从健康六月龄内的小牛取血后迅速置于低温冷库(≤-15℃)中存放三天以上。

从低温冷库(≤-15℃)取出小牛血在35±2℃的水浴池中融化。待全部融化为液态无硬心时，再次放入低温冷库(≤-15℃)冷冻三天以上后取出融化，如此反复三次。

在反应罐内加入融化的小牛全血和等体积的注射用水。夹层蒸汽将罐内温度加温至80℃，保温30分钟。

先用滤布过滤弃渣，再离心(14000rpm/min)后取上清液。

将上清液冷却至0-5℃，在不断搅拌下按小牛血体积1∶1的比例加入-10～-20℃预冷的冷丙酮，在不高于5℃的低温环境下静置2小时后，迅速离心，弃沉渣取上清液。