[发明专利]多拷贝高效表达重组菌丝霉素的毕赤酵母

权利要求书

1.一种表达菌丝霉素的酵母细胞，其特征在于，所述酵母细胞的染色体中整合有表达菌丝霉素的构建物，所述构建物含有2-16个串联排列的菌丝霉素表达盒，每个所述菌丝霉素表达盒包括以下元件：(a)起始信号元件为醇氧脱氢酶强启动子(AOX)；(b)α-因子信号肽基因及融合在其C端的菌丝霉素基因；(c)终止信号元件为AOX(TT)。所述酵母细胞在甲醇诱导下表达菌丝霉素，表达量与菌丝霉素基因拷贝数之间存在线性关系。

2.如权利要求1所述的表达菌丝霉素的酵母细胞，其特征在于，所述酵母细胞选自毕赤酵母、酿酒酵母或汉逊酵母，优选的，所述酵母细胞选自毕赤酵母，更优选的，所述酵母细胞选自毕赤酵母X-33。

3.如权利要求1所述的表达菌丝霉素的酵母细胞，其特征在于，所述的构建物衍生于酵母表达载体，优选的，所述酵母表达载体为pPIC系列表达载体，更优选的，所述的表达载体采用pPICZαA，且菌丝霉素基因包括SEQ ID NO.1所示的序列。

4.一种构建物，其特征在于，所述构建物含有2-16个串联排列的菌丝霉素表达盒，每个所述菌丝霉素表达盒包括以下元件：(a)起始信号元件为醇氧脱氢酶强启动子(AOX)；(b)α-因子信号肽基因及融合在其C端的菌丝霉素基因；(c)终止信号元件为AOX(TT)；

5.构建权利要求4所述的构建物的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)将菌丝霉素基因定点插入包括起始信号元件、信号肽和终止信号元件的质粒中，以获得单拷贝表达质粒；

(2)对所述单拷贝表达质粒含有完整的菌丝霉素表达盒，其中，所述表达盒包含：(a)起始信号元件为醇氧脱氢酶强启动子(AOX)；(b)α-因子信号肽基因及融合在其C端的菌丝霉素基因；(c)终止信号元件为AOX(TT)；

(3)采用限制性内切酶BglII和BamHI粘性末端能互补的原则，通过反复酶切、连接和转化操作，将所述菌丝霉素表达盒重复插入所述质粒中，从而获得含有2-16个串联排列的菌丝霉素表达盒的构建物。

6.权利要求1所述的表达菌丝霉素的酵母细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：用权利要求4所述的构建物转化酵母细胞，其所述的构建物整合入酵母染色体中，从而获得权利要求1所述的表达菌丝霉素的酵母细胞。