[发明专利]一种适用于工业化生产的分离纯化纳豆激酶的方法

权利要求书

1.一种适用于工业化生产的分离纯化纳豆激酶的方法，包括以下步骤：

(1)发酵液的预处理：发酵所得约10L发酵液放罐后立即进行板框过滤或离心去杂，滤液转移至沉淀罐。将研细的(NH₄)₂SO₄按照20％饱和度加入到沉淀罐中，4℃下保存过夜，弃去沉淀(沉淀为初步分离的杂蛋白)，收集上清液备用。将上清液移至另一沉淀罐，加入乙醇至75％饱和度，4℃下保存过夜，弃去上清液，收集沉淀，用10mmol/L pH9.0的磷酸缓冲液溶解残渣，定容到1L，测定各项指标。

(2)阴离子交换树脂去杂：用Styrene-DVB大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂(南开大学化工厂)去除杂质和色素。其操作步骤为：装柱、10mmol/L pH 9.0的磷酸缓冲液平衡、上样、收集滤过液、浓缩。

(3)阳离子交换介质分离：选择Styrene-DVB大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂做为离子交换的介质。其操作步骤为：装柱、10mmol/L pH 6.4的磷酸缓冲液平衡、上样、磷酸缓冲液洗柱、含1.0mol/L NaCI的磷酸盐缓冲液洗脱、分部收集、测定各部分活性和纯度、收集合并活性部分、浓缩。

(4)大孔吸附树脂层析纯化：采用HPD-400大孔吸附树脂(上海精科实业有限公司)进一步纯化以得到95％以上的纯品。其操作步骤为：装柱、平衡、上样、40％乙醇洗脱；分部收集，测定酶活和纳豆激酶含量，合并高酶活和高含量的洗脱液。

(5)冷冻干燥：采用薄膜浓缩法对洗脱液进行除菌和浓缩，冷冻干燥，得到纳豆激酶纯品。

2.根据权利要求1所述的纳豆激酶纯化工艺，其特征在于步骤(1)所述将纳豆菌发酵液采用板框过滤去除杂质。或采用离心去杂，采用高速冷冻离心机，转速8000～12000r/min，离心时间5～10min。

3.根据权利要求1所述的纳豆激酶纯化工艺，其特征在于步骤(2)所述的阴离子交换所用的树脂是取1.2kg用15倍于树脂量的0.5mol/L HCl浸泡30～120分钟，以水清洗至pH7.0，之后用0.5mol/L HCl浸泡30～120分钟，再以水清洗至pH 7.0，最后用欲使用的缓冲液浸泡，装成柱体积为2L的层析柱。

4.根据权利要求1所述的纳豆激酶纯化工艺，其特征在于步骤(3)所述的阳离子交换树脂柱是取1.2kg用15倍于树脂量的0.5mol/L NaOH浸泡30～120分钟，以水清洗至pH 7.0，之后用0.5mol/LHCl浸泡30～120分钟，再以水清洗至pH 7.0，最后用欲使用的缓冲液浸泡，装成柱体积为2L的层析柱。

5.根据权利要求1所述的纳豆激酶纯化工艺，其特征在于步骤(4)所述的树脂的预处理采用如下方法：称取1.6kg的树脂，加2％的NaOH浸泡过夜，用蒸馏水洗至中性，再加95％乙醇浸泡2h，然后用蒸馏水洗至乙醇完全除尽，置于50℃恒温烘箱中烘干备用。

6.根据权利要求1所述的纳豆激酶纯化工艺，其特征在于步骤(5)所述的滤膜为0.22μm滤膜。

7.根据权利要求1所述的纳豆激酶纯化工艺，其特征在于步骤(5)所述的冷冻干燥条件为：冷冻温度-40℃，真空干燥温度5～10℃，冷冻干燥时间24～36h。