[发明专利]特异促成软骨分化的核心结合因子al基因重组病毒及其制备方法和应用

权利要求书

1.特异促成软骨分化的核心结合因子a1基因重组病毒，其特征在于：包含一个由Sox9基因启动子调控的核心结合因子a1基因表达盒。

2.根据权利要求1所述特异促成软骨分化的核心结合因子a1基因重组病毒，其特征在于：病毒载体为复制缺陷型腺病毒载体。

3.权利要求1或2所述特异促成软骨分化的核心结合因子a1基因重组病毒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

a、核心结合因子a1基因全长cDNA的克隆及核心结合因子a1基因重组腺病毒穿梭质粒的构建：根据核心结合因子a1基因全长cDNA的核苷酸序列设计并合成核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的上、下游引物，以人成骨细胞总RNA为模板，通过RT-PCR扩增获得核心结合因子a1基因全长cDNA，再定向克隆至复制缺陷型腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV的多克隆位点Xho I和EcoRV之间，获得核心结合因子a1基因重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV/Cbfa1；

b、Sox9基因启动子片段的克隆及Sox9基因启动子重组表达载体的构建：根据Sox9基因启动子片段的核苷酸序列设计并合成核苷酸序列分别如SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4所示的上、下游引物，以小鼠软骨细胞系ATDC5的基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得Sox9基因启动子片段，再定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1的多克隆位点BglII和Sal I之间，获得Sox9基因启动子重组表达载体pEGFP/Sox9pro；

c、Sox9基因启动子调控的核心结合因子a1基因重组腺病毒载体的构建：自步骤b所得Sox9基因启动子重组表达载体pEGFP/Sox9pro中用BglII和Sal I双酶切出Sox9基因启动子片段，再定向克隆至步骤a所得核心结合因子a1基因重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV/Cbfa1的多克隆位点BglII和Sal I之间，获得Sox9基因启动子调控的核心结合因子a1基因重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-Sox9pro/Cbfa1，将其用Pme I酶切使线性化后，再转化AdEasier-1细胞与复制缺陷型腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行细胞内同源重组，获得Sox9基因启动子调控的核心结合因子a1基因重组腺病毒载体pAdEasy-1/Sox9pro-Cbfa1；

d、Sox9基因启动子调控的核心结合因子a1基因重组腺病毒的包装、扩增和纯化：将步骤c所得Sox9基因启动子调控的核心结合因子a1基因重组腺病毒载体pAdEasy-1/Sox9pro-Cbfa1用脂质体法转染人胚胎肾293细胞，待细胞出现明显病变时，离心收集细胞，反复冻融使细胞裂解，离心收集含病毒上清液，获得第一代重组腺病毒悬液；将第一代重组腺病毒悬液感染人胚胎肾293T细胞以扩增病毒，待细胞出现明显病变时，离心收集细胞，反复冻融使细胞裂解，离心收集含病毒上清液，获得第二代重组腺病毒悬液；按照上述操作连续感染扩增病毒几代后，将所得含病毒上清液采用氯化铯密度梯度超离心法纯化，即得Sox9基因启动子调控的核心结合因子a1基因重组腺病毒Sox9pro-Cbfa1。

4.权利要求1或2所述特异促成软骨分化的核心结合因子a1基因重组病毒在制备定向诱导成软骨分化的种子细胞中的应用。

5.利用权利要求1或2所述特异促成软骨分化的核心结合因子a1基因重组病毒制备定向诱导成软骨分化的种子细胞的方法，其特征在于：先用特异促成软骨分化的核心结合因子a1基因重组病毒转染间充质干细胞，再用成软骨诱导培养基培养已感染重组病毒的间充质干细胞，诱导间充质干细胞定向成软骨分化。