[发明专利]检测多刺曼陀罗的引物、试剂及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及农业和植物检验检疫技术领域，具体涉及一种利用分子生物学检测技术快速准确地检测多刺曼陀罗(D.ferox)的核酸组合物，采用实时荧光PCR检测技术，该组合物适用于口岸检验检疫、农业生产和植物保护等领域当中。

背景技术

曼陀罗属(Datura L.)，为茄科植物。世界上每年都会发生曼陀罗中毒事件，另外，由于曼陀罗属许多种被广泛地用于药物学和园艺学，因此，该属许多种在世界各地和我国均有大量栽培，导致该属在世界范围内广泛分布。在进口货物如大豆中，经常有截获有毒和有害杂草曼陀罗属种子的报道，且种子鉴定易发生混淆。目前在国内外文献中常出现的曼陀罗属的植物名称有：多刺曼陀罗(D.ferox)，栎叶曼陀罗(D.quercifolia)，曼陀罗(D.stramonium)，木本曼陀罗(D.arborea)，美丽曼陀罗(D.candida)，湿地曼陀罗(D.ceratocaula)，异色曼陀罗(D.discolor)，无刺曼陀罗(D.inermis)，毛曼陀罗(D.inoxia)，光曼陀罗(D.leichhardtii)，洋金花(D.metel)，紫花曼陀罗(D.tatula)，柏哈地曼陀罗(D.bernhardii)，红花曼陀罗(D.sanguinea)等，其中多刺曼陀罗的异名为D.quercifolia。

实际工作中，农产品中夹杂的曼陀罗杂草种子的外观特征往往会因运输受到磨损与变形，同时由于环境、气候、栽培条件的影响、种子成熟度的不同等引起的个体差异，更为形态鉴定增加了难度，而细胞生物学方法等需要的周期比较长且难以准确鉴定。

目前，细胞学研究表明曼陀罗(D.stramonium)和多刺曼陀罗(D.ferox)的随体和二价体形状和数目最接近；生物化学的研究表明曼陀罗(D.stramonium)和多刺曼陀罗(D.ferox)的同工酶最近似；在分子水平，利用AFLP技术发现曼陀罗(D.stramonium)和多刺曼陀罗(D.ferox)的相似距离最近，在进化树上归为同一组。迄今为止，尚未有分子水平的研究成果可用于鉴定多刺曼陀罗(D.ferox)。

发明内容

本发明的一个目的在于克服上述现有技术中关于形态鉴定和细胞生物学方法存在的困难，提出采用分子生物学的方法，对核糖体内转录间隔区(InternalTranscribed Spacers，ITS)序列差异设计多刺曼陀罗(D.ferox)的检测用引物。

本发明的另一个目的在于，建立多刺曼陀罗(D.ferox)的PCR检测方法，将核酸组合物用于口岸检验检疫、农业生产和植物保护等领域当中，以达到快速和准确的检测鉴定。

本发明提供的检测多刺曼陀罗(D.ferox)的引物是基于多刺曼陀罗(D.ferox)与其近似种在rDNA内转录间隔区序列上的差异设计的。18S～26S核核糖体DNA(nrDNA)的内转录间隔区ITS分为ITS1和ITS2两部分。ITS区在植物核基因组中是高度重复的。全部nrDNA重复单位包括4万个拷贝以串联重复(tandemrepeats)方式出现在一个或多个染色体基因位点上(Hamby R K，Zimer EA.Ribosomal RNA as a phylogenetic tool in plant systematics of plants[M].Chapman and Hall，New York，NY.1992，50～91.)。在被子植物中，ITS区既具有核苷酸序列的高度变异性又有长度上的保守性，说明这些间隔区的序列很容易在近缘类群间排序，而且丰富的变异可在较低的分类阶元上(如：属间和种间)解决植物系统发育问题。屈良鹄和陈月琴(1999)(生物分子分类检索表——原理与方法，中山大学学报(自然科学版)[J].1999，38(1)：1-6)通过对不同生物类群的ITS序列(自生物学数据库)的比较得出：被子植物大多数科属的ITS序列的种间差异值为1.2％～10.2％，属间差异值为9.6％～28.8％，这对系统发育研究来说都是较合适的范围。

本发明提供的一种检测多刺曼陀罗的引物，包括核酸引物DF1M和核酸引物DF2。

核酸引物DF1M，即上游引物，其5’端至3’端序列为：TTAAGACGTGCGCGGGCT。

核酸引物DF2，即上游引物，其5’端至3’端序列为：ATGCGTGACGCCCAGGCAGA。

根据核苷酸碱基配对规则可以推知，与本发明提供的核酸引物DF1M和核酸引物DF2核酸序列完全互补的核酸链组成的一组核酸组合物也适用于本发明当中。