[发明专利]纹枯病菌毒素在水稻抗纹枯病育种中的应用方法

说明书

技术领域

本发明公开了一种利用纹枯菌毒素开展水稻抗纹枯病育种的方法，属于水稻抗病育种技术领域。

背景技术

纹枯病菌在人工培养和侵染过程中均会产生多种对寄主有毒的物质，人们将其统称为毒素。由于技术手段的局限性，长期以来，一直未有学者获得纹枯菌毒素纯品，因此，关于纹枯菌毒素的成分是什么，至今未有定论。实际研究中采用的毒素均是粗毒素（以下统称为毒素），为非纯品，可能包含一些培养基成分和/或病原菌分泌的对寄主无毒的物质。

少数研究结果预示，毒素可应用于品种的抗病选育。然而，关于具体应用方法，未见报道。本专利主要介绍如何将纹枯病菌毒素应用于水稻抗纹枯病育种中，涉及的背景技术有以下3个方面：

1、毒素提取方法。不同毒素提取方法间的差异主要体现在2个方面，一是提取前的病原菌培养液不同，常用培养液有改良Richard培养液、Czapek培养液和马铃薯蔗糖培养液。徐敬友等（2004）研究表明，病菌在改良Richard培养液中产毒能力强于另2种培养液，且发现在25-30℃条件下培养15天的毒素活性最高，培养过程中需要每隔12小时摇晃一次。二是提取方法不同，常用方法有活性炭吸附法、酸度调节萃取法、活性炭吸附萃取法、乙醚萃取法。不同方法间的差异致使获得的毒素活性或量上存在较大差异，比较显示，乙醚萃取法获得的毒素活性最强（孟令军等，2009）。

总体而言，以上提取方法均是植物病理学专家欲分离纯毒素或分析毒素成分而提出的方法，提取过程中均包含一定的纯化环节，即去除对寄主无毒的物质。然而，就水稻抗病育种应用而言，在保持同样产毒量或活性基础上，这些方法可简化，使其更方便快捷、经济实惠。

2、水稻抗毒素测定方法。已报道的水稻抗毒素测定方法有3种，即胚根抑制法、幼苗致萎法和针刺接种法。研究表明，采毒素处理破胸露白的水稻种子，可抑制种子胚根胚芽生长，尤其对胚根生长抑制作用最明显，处理3叶期水稻幼苗时，可致幼苗萎蔫死亡；通过针刺法将毒素接种于水稻叶片、叶鞘上，可诱发相似于纹枯病的典型症状。通过胚根抑制法和针刺接种法，少数研究还发现，一些抗病品种对毒素的忍耐性总体强于感病品种，抗感毒素水平与其抗感纹枯病水平间存在一定正相关性。因此，一些学者推测认为，水稻对纹枯菌毒素的忍耐水平可用作水稻抗病品种的一个筛选标准。

然而，我们研究发现，毒素浓度过高过低均不能有效揭示抗感品种间的抗毒素差异，浓度过高可导致所有测定品种的胚根生长受抑制、幼苗萎蔫致死，受害症状相同，抗感差异无法显示。同样，浓度过低则不产生抑制或致萎效果，也无法显示抗感差异。因此，在水稻抗病育种中，一定要采用合适的毒素浓度才能选育到较抗品系（种），但是至目前，还未见到用于水稻抗纹枯病品种选育的合适的毒素浓度的确定方法。

3、水稻纹枯病抗性鉴定方法。在水稻抗纹枯病遗传和育种研究领域中，已报道的水稻纹枯病抗性鉴定方法主要有捆扎法、撒施法、嵌入法、注射法（潘学彪等，1997）和苗期鉴定法。除了苗期鉴定法在温室中进行以外，其他方法均在大田进行。田间鉴定的环境不可控，耗时费力，效率低，通常一年只能鉴定一次，每次鉴定耗时也都在2个月以上。苗期温室接种方法虽然将鉴定周期缩短至1个月左右，且减少了环境影响因素，但是对苗龄大小或植株高矮等要求较高，增加了试验难度。总体而言，所有这些方法在大规模抗病育种中，都显得低效、耗时、费力，尤其在低世代分离群体中，缺乏可操作性。

发明内容

本发明为了解决现有技术的不足，提供了一种纹枯病菌毒素在水稻抗纹枯病育种中的应用方法，该方法简便快捷，尤其适合在低世代分离群体中应用。

本发明所采用的技术方案是：一种纹枯病菌毒素在水稻抗纹枯病育种中的应用方法，包括以下步骤：

（1）用水稻叶片和纯净水的无菌混合物为培养基培养纹枯菌并提取分泌的毒素；

（2）以纹枯病抗病品种YSBR1、感病品种Lemont为标准品种，将上述（1）中的毒素配成不同浓度梯度对标准品种种子进行胚根抑制法处理，取标准抗病品种YSBR1的胚根抑制率在45-60%之间同时标准感病品种Lemont的胚根抑制率在85%以上时的毒素浓度为最佳毒素浓度；

（3）采用最佳浓度的毒素通过胚根抑制法进行育种筛选，淘汰胚根生长明显受抑制的品种或个体。

上述步骤（1）中的培养基优选每100ml纯净水中3-4g水稻叶片的无菌混合物。