[发明专利]一种狂犬病病毒属诊断与分型芯片及制备方法

说明书

技术领域

本发明公开一种狂犬病病毒属诊断与分型芯片及芯片制备方法，用于狂犬病病毒属诊断与分型的基因芯片（或寡核苷酸微阵列），属于生物技术领域。

背景技术

狂犬病是一种所有温血动物都易感的人兽共患病，狂犬病的病原属于Lv。Lv属弹状病毒科（Rhabdoviridae）单分子负链RNA病毒目（Mononegavirales），具有高度的嗜神经性，常常引起人和动物的致命性脑脊髓炎。Lv主要包括7种基因型，分别为：基因1型经典狂犬病病毒Rabies Virus（RABV）；基因2型的Lagos bat virus（LBV）；基因3型的Mokola virus（MOKV）；基因4型的Duvenhage virus（DUVV）；基因5型的European bat lyssavirus 1（EBLV-1）；基因6型的European bat lyssavirus 2（EBLV-2）；基因7型的Australian bat lyssavirus（ABLV）。目前我国人和动物的狂犬病野外分离株均属于基因1型，尚无基因2~7型病毒自然感染病例的报道。

有效地检测病原是狂犬病流行病学调查的基础，由于同属的病毒常引起相同的临床症状，常规的免疫诊断和PCR检测难以同时完成Lv的诊断与分型。目前常用基因分型检测的方法整个过程繁琐，费用高，获得结果时间长。因此建立一种Lv快速有效的诊断与分型方法显得十分重要。基因芯片技术是一种大规模集成的固相杂交技术，其基本原理是核酸分子杂交，即依据 DNA双链碱基互补配对、变性和复性的原理，以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作为探针，检测样品中与其互补的核酸序列，通过特定的检测系统对杂交信号进行检测，并配以计算机系统对每一杂交信号数据定性、定量分析和处理，迅速得出待测品的基因序列及表达的信息。与传统基因诊断技术相比，基因芯片技术具有明显的优势，具备微型化、高通量、高度平行性和快速性的显著特点。目前基因芯片技术已被广泛应用于发现与疾病相关的新基因、基因表达分析、药物研究与开发和对生物样品中各种已知或未知病毒性病原体进行筛查、鉴定与分型的研究等。因此利用基因芯片技术对Lv诊断分型可弥补现有诊断方法的不足。

根据检索，2009年英国VLA实验室R.Gurrala等人利用随机PCR标记样品的方法结合基因芯片技术，建立了对Lv的芯片诊断与分型的方法。但是随机PCR扩增本身存在偏性以及非特异性扩增，即大量扩增某一区域的基因或不依赖模板的非特异性扩增，使得扩增产物中病毒核酸的含量低，导致基因芯片的灵敏度降低，还易造成非特异性杂交。而本发明利用了特异性扩增Lv的7个基因型的通用引物（本发明人申请的，专利号ZL 2007 1 0056129.4），针对每个基因型设计了并筛选了特异性的探针，不但提高了芯片的整体检测灵敏性，而且增加了芯片的特异性。

虽然目前的研究报道显示，我国Lv的野外分离株均属于基因1型，但是针对我国不同时期、不同省份狂犬病流行毒株的生态学、分子流行病学和遗传多样性的研究数据尚不充分，无法排除其他基因型的Lv的存在；同时考虑到大陆架构的特点，Lv易感物种分布的多样性，以及我国加入WTO后对外贸易和人口流动增多的实际情况，建立一种快速、灵敏、特异性强的，可以同时对Lv的多种基因型诊断和分型的技术成为我国狂犬病防治工作的主要内容之一。

发明内容

本发明公开一种狂犬病病毒属诊断与分型芯片及芯片制备方法，用于狂犬病病毒属诊断与分型的基因芯片（或寡核苷酸微阵列），克服了现有的Lv诊断和分型方法灵敏度低，技术繁琐，成本高和试验周期长的缺点。

本发明公开的狂犬病病毒属诊断与分型芯片，其特征如下：

醛基修饰的玻璃基片，点样区、探针矩阵、标签区，固定到玻片上的寡核苷酸探针组成，寡核苷酸探针5’端经氨基化修饰（见图1）；

本发明公开狂犬病病毒属诊断与分型芯片的制备方法如下：

（1）光学级醛基修饰的玻璃基片和点样液；

（2）设计与合成Lv基因型特异探针

设计探针：根据GenBank数据库中登录的Lv各基因型全基因序列和N基因序列，利用生物信息学软设计寡核苷酸探针。阳性对照探针为与目的基因同源型低的pGM-T载体序列设计，阴性对照探针根据拟南芥的基因组设计。所有寡核苷酸探针5’端氨基化修饰，人工合成。

（3）芯片点制设计及点样后处理