[发明专利]一种有效提高卷叶贝母总生物碱含量的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高卷叶贝母总生物碱含量的培养方法，特别是涉及一种通过在液体培养基中添加特定氨基酸前体物来有效提高卷叶贝母总生物碱含量的培养方法。

背景技术

卷叶贝母(Fritillaria cirrhosa D.Don)是百合科多年生草本植物，其鳞茎为名贵的川产药材川贝母。中药材川贝母用于治疗肺热燥咳，阴虚劳嗽，肺虚久咳不愈等症，功效显著，每年的用量都在逐年增大，目前以川贝母为主药或包含川贝母的中成药有130多种。长期以来，川贝母药材主要依靠采挖野生药材为主，因过量采集和生境遭到破坏等因素，使其蕴藏量急剧下降，再加之人们对川贝母药材的需求量进一步增加，因而最终导致其价格不断攀升，药材市场的缺口越来越大。

为了快速获得川贝母药材，以满足川贝母药材市场的大量需求，人们开始采用生物技术方法来实现川贝母药材的快速生产。当前采用组织培养技术进行卷叶贝母的快速繁殖已获得成功，如王跃华等人已完成了卷叶贝母愈伤组织诱导和快速增殖、鳞茎再生、细胞团块悬浮培养和卷叶贝母组培苗快速培育等研究。通过对卷叶贝母总生物碱含量测定结果显示，组织培养生产的卷叶贝母总生物碱含量明显高于野生卷叶贝母鳞茎中的总生物碱含量。高山林等人对川贝母组培物的化学成分和药理作用进行了研究，检测结果显示，通过组织培养获得的鳞茎和商品鳞茎有一致的化学成分，都具有生物碱、有机酸、皂甙氨基酸等13种化学物质；通过药理实验结果显示，组培川贝与野生川贝同样具有镇咳祛痰作用，而且药物毒性均较低，比较安全。

目前在对卷叶贝母的生物技术研究中，还未见采用前体饲喂技术来显著提高液体培养中卷叶贝母的总生物碱含量的报道。前体饲喂是在药用植物组织培养中，通过加入次生代谢物合成的前体物质来提高细胞中次生代谢物的含量。这是因为植物细胞中的次生代谢物是通过植物体内一系列代谢过程产生的，在组织培养过程中将适宜的代谢中间产物添加入培养基中，能有效地促进次生代谢物的大量生成。生物碱在植物体内的合成大部分是由苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等α-氨基酸经过一系列生化反应而产生的。卷叶贝母的主要有效组分是生物碱类物质，因此通过在液体培养基中添加氨基酸前体来提高液体培养的卷叶贝母再生鳞茎的总生物碱含量在理论上是可行的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种有效提高卷叶贝母总生物碱含量的培养方法，该方法是通过在卷叶贝母再生鳞茎的液体培养过程中添加氨基酸前体物来有效提高卷叶贝母培养物中的总生物碱含量。

为达到上述目的，本发明采用的解决方法包括下列步骤：

(1)卷叶贝母再生鳞茎的获得：将诱导产生的已开始初步分化的紧密愈伤组织切成1.5～2.5cm的小块，转接到产生再生鳞茎的培养基MS+6-BA 1～2.0mg·L^-1+NAA0.1～0.3mg·L^-1+蔗糖20～60g·L^-1+琼脂5.5～7.0g·L^-1中进行培养，所采用的pH值为5.5～6.5，培养温度15～23℃、每天光照8～16小时、光照强度为1000～1800lx；经40d左右培养后，可获得大量生长良好的再生鳞茎；

(2)卷叶贝母再生鳞茎的液体培养：切取(1)步骤获得的直径为3～6mm、未抽芽的卷叶贝母再生鳞茎，转接到加有氨基酸前体物的液体培养基MS+6-BA2.0mg·L^-1+NAA0.2～1.0mg·L^-1+蔗糖20～60g·L^-1中进行培养，pH 5.5～6.5，接种量为30～50g·L^-1，培养温度15～23℃、每天光照8～16小时、光照强度为1000～1800lx、摇床转速110～130r·min^-1，培养24～28d后，即获得总生物碱含量高的再生鳞茎，上述氨基酸前体物为苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸中的任意一种，加入量为0.25～1.00mmol·L^-1。

将上述培养的再生鳞茎从液体培养基中滤出，用干燥滤纸拭干表面水分后，称取重量，即为鲜重；其生物量增殖倍数＝(收获量鲜重-接种量鲜重)/接种量鲜重。

将上述培养的再生鳞茎从液体培养基中滤出，用干燥滤纸拭干表面水分后，置于60℃的烘箱中烘干至恒重，用分光光度法在412nm处测定吸光度，可计算出培养物中总生物碱含量。