[发明专利]一种固定化环糊精葡萄糖苷转移酶及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种固定化环糊精葡萄糖苷转移酶及其制备方法和应用

背景技术

L-抗坏血酸(简称VC)在体内发挥着重要的生理作用，但其还原性强，极不稳定，这使得它在应用上受到了很大的限制。VC的衍生物则大大提高了它的稳定性，而不影响它的生理功能。本专利就其衍生物之一2-O-葡萄糖基抗坏血酸在糖基转移酶的作用下的生物合成。

2-O-葡萄糖基抗坏血酸有着比L-抗坏血酸更广泛的应用价值，其生物转化合成法是唯一的生产方法。1990年日本林原生物化学研究所与冈山大学药学系共同发现2-O-葡萄糖基抗坏血酸(AA-2G)，并已确定大量合成这种维生素C衍生物的方法。目前的研究主要集在对AA-2G生理功能研究。对于产量的提高主要通过筛选能产糖基转移酶和优化发酵过程中的参数等来提高转化效率。Prousoontorm等人通过共价结合的方法将环糊精葡萄糖苷转移酶结合在3-Aminopropyltriethoxysilane(APTS)上。(Production of 2-O-a-glucopyranosyl L-ascorbic acid from ascorbic acid and b-cyclodextrin using immobilized cyclodextrin glycosyltransferase，Incl Phenom Macrocycl Chem(2007)57：39-46)。虽然上述方法得到了固定化环糊精葡萄糖苷转移酶，但是固定化后对酶活的损失很大，不到游离酶的一半。目前开发的固定化环糊精葡萄糖苷转移酶，主要存在如下不足：(1)热稳定性和贮存稳定性较差，不适合AA-2G的生产；(2)固定化成本较高，不适合工业化生产。

发明内容

本发明的所要解决的一个技术问题是提供一种固定化环糊精葡萄糖苷转移酶的制备的方法。

为解决上述技术问题，提供如下技术方案：

首先环糊精葡萄糖苷转移酶的酶液中加入分子筛吸附，其次加入戊二醛使混合液交联，再经海藻酸钠和氯化钙的包埋，得到固定化的环糊精葡萄糖苷转移酶。

具体步骤如下：

向酶液中加入2-10mg/mL的分子筛，置于摇床在16℃，150rpm下充分吸附；添加10μL/mL 25％的戊二醛溶液，使环糊精葡萄糖苷转移酶与分子筛交联4h；加入20mg/mL海藻酸钠，与溶液混匀，放入4℃冰箱过夜脱气；用注射器逐滴滴入浓度为3％CaCl₂溶液硬化1h，收集胶囊用蒸馏水冲洗至无蛋白析出，将冲洗后的胶囊置甘油中4℃冰箱保存备用。

所述环糊精葡萄糖苷转移酶来源于Paenibacillus macerans JFB05-01(CCTCC NO：M208063)，通过Escherichia coli BL21(DE3)(pET-20b(+)/cgt)在胞外表达。(Calcium Leads to Further Increase in Glycine-Enhanced Extracellular Secretion of Recombinant r-Cyclodextrin Glycosyltransferase in Escherichia coli，J.Agric.Food Chem.2009，57，6231-623)

所述Escherichia coli BL21(DE3)(pET-20b(+)/cgt)培养条件：

(1)种子培养：将保藏的菌种接入装有50ml LB培养基的250ml三角瓶中，回旋式摇床转速200r/min，培养温度为37℃，培养8小时。

(2)发酵培养：将培养好的种子培养液按4％(v/v)的接种量，接种至装有100mL TB培养基的500mL三角瓶中进行发酵培养，开始培养温度为30℃，摇床转速200r/min，当菌体培养至OD₆₀₀为0.6时，添加IPTG至0.01mM，同时添加一定量的甘氨酸或CaCl₂，迅速转至25℃摇床，继续诱导90h。

上述各培养基中使用前添加100μg/mL氨苄青霉素。

所述酶液可以为去除菌体后的发酵液，或上述发酵液去除杂质得到的精制酶液，其中环糊精葡萄糖苷转移酶的活力为160U/mL。

本发明所要解决的另一个问题是提供一种通过上述方法制备的固定化环糊精葡萄糖苷转移酶。

所述固定化环糊精葡萄糖苷转移酶的最适温度45℃，最适pH为5.0，贮存两个月后仍然保持71.1％活力(图4)。