[发明专利]一种制备β-甘露聚糖酶的方法及专用菌株

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备β-甘露聚糖酶的方法及专用菌株。

背景技术

β-甘露聚糖酶(β-1，4-D-mannan mannohydrolase；EC31211178)是一类降解甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖的主链β-1，4-D-甘露吡喃糖的酶，它在利用现存在于一些植物如干椰子肉的胚乳、象牙棕榈树的坚果、瓜尔豆、洋槐、咖啡树以及魔芋的块茎中的各种β-甘露聚糖有着潜在的重要性。国内外现主要用于造纸工业纸浆的漂白、油井的破胶、降解植物胶生产低聚糖用作双歧杆菌促生长因子，防病抗衰老的保健食品以及饲料工业中作为抗营养因子。

β-甘露聚糖酶按其最适pH值的不同有酸性、中性、碱性之分，其中碱性β-甘露聚糖酶是指在碱性条件下催化活力最高的β-甘露聚糖酶，其研究相对较晚，发现主要由嗜碱芽孢杆菌产生，某些地衣芽孢杆菌也产生碱性β-甘露聚糖酶，如杨文博等报道了一株地衣芽孢杆菌NK-27，其最适pH值为9.0。一般情况下枯草芽孢杆菌，放线菌等产生中性β-甘露聚糖酶，而霉菌产生酸性β-甘露聚糖酶。第一个碱性甘露聚糖酶由Akino等发现。马延和等于1991报道了嗜碱芽孢杆菌N16-5的三个胞外碱性甘露聚糖酶的纯化及酶学性质，并于2004年报道了其中一种嗜碱甘露聚糖酶的基因序列。Takeda等于2004年发现了芽孢杆菌属的一个菌株JAMB-602产碱性甘露聚糖酶，此酶属于GH家族5，最适pH为9。目前所发现的嗜碱甘露聚糖酶的最适pH值最高为10，由Takeda等于2004年报道。

碱性β-甘露聚糖酶不仅可以生产用作双歧杆菌促生长因子的低聚糖，而且在需碱性环境的纸浆漂白等工业方面具有广泛的应用前景。但到目前为止，碱性β-甘露聚糖酶的制备仍旧是限制其工业应用的瓶颈，前人的报道中无论是使用碱性β-甘露聚糖酶的原产菌株还是使用重组菌株生产，其产量都比较低。

马延和等于1991报道了嗜碱芽孢杆菌N16-5的三个胞外碱性甘露聚糖酶的纯化及酶学性质，并于2004年报道了其中一种嗜碱甘露聚糖酶的基因序列，其基因的编码区序列如SEQ ID NO：1中第7-1407位所示。

PTM₁溶液：将Cu SO₄·5H₂O 6g，KI 0.08g，MnSO₄ 2.68g，H₃BO₃ 0.02g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2g，ZnSO₄·7H₂O 20g，FeSO₄·7H₂O 65g，CoCl₂·6H₂O 0.916，H₂SO₄5mL，生物素0.2g混合，用水定容至1升，得到PTM₁溶液。

每1升BMGY液体培养基按照如下方法制备：将8克-12克或10克酵母提取物、18克-22克或20克蛋白胨、12克-15克或13.4克YNB、3×10^-4克-5×10^-4克或4×10^-4克生物素和8克-12克或10克甘油溶于水中，用水定容至1升，得到BMGY液体培养基。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种重组菌。

本发明所提供的重组菌，是将β-甘露聚糖酶的编码基因导入出发菌株，得到的重组菌；所述β-甘露聚糖酶的编码基因序列如SEQ ID NO：1中第7-1407位核苷酸所示。

上述重组菌中，所述β-甘露聚糖酶的编码基因是通过重组载体导入出发菌株的；所述重组载体为如下(1)或(2)或(3)所示：

(1)将SEQ ID NO：1所示DNA片段插入pAO815alpha的XhoI和EcoRI酶切位点间，得到的重组载体，记作pAOα-1sman；其中，XhoI酶切位点位于SEQ ID NO：1所示DNA片段的5′端上游，EcoRI酶切位点位于SEQ ID NO：1所示DNA片段的3′端下游；

(2)用BamHI/BglII双酶切pAOα-1sman，回收2932bp片段；用BamHI单酶切pAOα-1sman，回收载体大片段；将所述2932bp片段和所述载体大片段连接，得到的重组载体，记作pAOα-2sman；