[发明专利]基于重组表达流感病毒血凝素和神经氨酸酶的真核细胞凝集反应的流感病毒抗体检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于重组表达流感病毒血凝素和神经氨酸酶的真核细胞凝集反应的流感病毒抗体的检测方法。

背景技术

特定血清型流感病毒感染、感染后恢复、隐性感染、以及疫苗接种的人或动物，在其体液(如血清、支气管灌洗液、血浆、组织液等)中会出现流感病毒血凝素抗体，通过检测特定血清型流感病毒的抗体，可以判断、诊断或确诊该人或该动物是否感染(包括早期感染、隐性感染或感染后恢复等)该特定血清型的流感病毒、或接种过流感病毒疫苗、或评价其对特定血清型流感病毒的抵抗力等。

目前检测待检样品中是否存在某一特定血清型的流感病毒抗体的方法，主要有血凝抑制实验(HAI)和中和实验，即将某一特定血清型的流感病毒先与待检样品混合，然后加入红细胞或敏感细胞中，判断待检样品是否能够抑制该病毒的血凝反应或细胞病变效应来进行判定，其缺点是需要使用具有感染性的病毒，安全性存在隐患。在涉及病毒的实验中，根据国家有关法规(国务院《病原微生物实验室生物安全管理条例》、卫生部《人间传染的病原微生物名录》、《人间传染的高致病性病原微生物实验室和实验活动生物安全审批管理办法》)及WHO的规定与建议，包括人H2N2以及部分禽流感病毒的操作要求在BSL-III(P3)实验室进行，因此，上述方法的开展对实验室条件要求很高，不适用于现场检测和规模检测。文献也有报道，利用表达流感病毒HA的假病毒颗粒来代替具有感染性的流感病毒进行HAI实验，但技术过于复杂。

上述方法的缺点还在于只能检测流感病毒HA的抗体。流感病毒表面主要存在着2种抗原性较强的糖蛋白刺突，即血凝素NA和神经氨酸酶NA，当流感病毒感染或隐性感染或接种疫苗后，人或动物的机体会针对HA和NA都产生抗体，正是如此，流感病毒中的甲型流感病毒根据HA的抗原性分为H1-H16等16个亚型，NA的抗原性分为N1-N9等9个亚型，在甲型流感病毒中根据HA和NA亚型的不同组合方式形成了众多亚型，如H5N1(即H5亚型与N1亚型组合)。因此，如检测流感病毒抗体，除需检测HA血清型外，还需要对NA血清型进行检测。而目前对NA血清型抗体的检测则需要另行通过神经氨酸酶酶活抑制的方法进行检测。

除经典的HAI和中和实验外，也有用ELISA方法和乳胶凝集实验方法来进行检测的报道。ELISA和乳胶凝集的优势在于可以检测HA和NA的抗体。其中，ELISA方法是利用重组表达和纯化的流感病毒HA和/或NA来检测相应的抗体，这需要获保持抗原特异性的重组蛋白的表达与纯化，且由于流感病毒有众多亚型，即使同种亚型的血清交叉反应强度不一，对不同血清型的HA和NA抗原都进行重组蛋白的表达与纯化，其工作量大、工艺要求高、批间稳定性差。乳胶凝集方法相对于现有的其它方法(HAI、中和实验以及ELISA方法)而言，反应时间短、适合现场检测，但仍存在一些不足。乳胶凝集实验方法是将重组表达和纯化的流感病毒HA和/或NA蛋白偶联在惰性乳胶颗粒表面，利用凝集反应进行检测流感病毒相应的抗体，这同样需要重组表达和纯化的流感病毒HA和NA，并需要获得保持抗原特异性的重组蛋白的表达与纯化，如需要检测不同血清型的流感病毒HA和NA抗体，就需要对不同毒株的HA和NA进行重组表达和纯化，与ELISA方法一样，存在工作量大、工艺要求高、批间稳定性差等问题。

由于检测流感病毒抗体对人或该动物是否感染(包括早期感染、隐性感染或感染后恢复等)该特定血清型的流感病毒、或接种过流感病毒疫苗、或评价其对特定血清型流感病毒的抵抗力等有重要意义，而目前的HAI、中和实验、ELISA以及乳胶凝集等检测手段，或需要使用具有感染性的病毒，或需要特定的实验条件和设备，或工艺复杂，或检测耗时长等缺点，因此，一种简便、快速、工艺相对简单易控的，可以同时检测流感病毒HA和NA抗体检测方法具有广泛的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于根据现有技术中用于检测流感病毒抗体的方法中存在的工艺复杂、检测耗时长、稳定性差等问题，提供一种快速、简便、稳定性好的基于重组表达流感病毒血凝素和神经氨酸酶的真核细胞凝集反应的流感病毒抗体的检测方法。

本方法上述目的通过以下技术方案予以实现：

本发明方法是将流感病毒血凝素基因和神经氨酸酶基因克隆后转染真核细胞，使真核细胞表面重组表达流感病毒血凝素和神经氨酸酶蛋白，与待检样品中的流感病毒血凝素抗体和神经氨酸酶抗体结合，发生凝集反应，根据是否发生凝集反应来检测待检样品中的流感病毒抗体