[发明专利]一种帘蛤科线粒体COI基因扩增引物的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种双壳贝类线粒体细胞色素c氧化酶亚基I(cytochrome c oxidase subunit I；COI)基因序列扩增引物的筛选方法，特别是涉及一种帘蛤科线粒体COI基因序列扩增引物的筛选方法。

背景技术

帘蛤科(Veneridae)贝类隶属于软体动物(Mollusca)，双壳纲(Biavalvia)，异齿亚纲(Heterodonta)，帘蛤目(Veneroida)，帘蛤超科(Veneracea)，是一种在世界范围内均有分布，数量大，经济种类多，具有很高商业价值的的贝类类群。据统计，帘蛤科贝类在全世界范围内有800多种，隶属于14个亚科，为双壳纲种类最为丰富的一个科。帘蛤科贝类中含有很多经济价值极高的种类，如菲律宾蛤仔Ruditapesphilippinarum、等边浅蛤Gomphina aequilatera、紫石房蛤Saxidomus purpuratus、文蛤Meretrix meretrix、青蛤Cyclina sinensis等。然而帘蛤科贝类很多种类形态可塑性很大，近源种之间形态差异细微，故相当大一部分帘蛤科贝类种间关系一直存在争议，国内外学者始终没有统一的看法。例如菲律宾蛤仔R..philippinarum由于贝壳形态、壳表颜色、壳表花纹等变化很大，早期分类学家将其定为dentivulata、indica、violascens、japoniaca、semidecussata、bifurcata和philippinarum等7个种。而在国内，菲律宾蛤仔往往被定名为与其形态相近的姊妹种杂色蛤仔(Ruditapes variegata)。

近年来，利用DNA序列对物种进行分类和进化研究已成为一种高效的方法，其中线粒体COI基因由于具有突变速率适中，单亲遗传等特点成为物种鉴定和生物系统学研究的理想基因。此基因序列已在许多生物类群特别是动物界的分类及进化研究中得到了成功的应用。并且，COI基因已成为鉴定物种和发现新种的新兴技术——DNA条形码(DNA barcoding)技术在动物类群中的标准基因。因此，COI基因是双壳贝类帘蛤科物种鉴定和系统发育研究最为理想的分子标记。

然而贝类COI序列的变异速率明显高于动物的其他类群：软体动物不同物种，即使是近源种甚至种内不同群体之间的COI序列变异都很大，这就导致了Folmer等人于1994年设计的COI通用引物LCO1490和HCO2198在这一动物类群中的扩增效率极低下。缺少扩增效率高的引物已经严重阻碍了帘蛤科贝类系统发生相关研究的进行。

发明内容

本发明的目的是提供一种帘蛤科线粒体COI基因扩增引物的筛选方法，它能满足现有技术的上述需求。

一种帘蛤科线粒体COI基因扩增引物的筛选方法，其特征是a、登陆美国国立生物技术信息中心，下载帘蛤科贝类的线粒体全序列；b、将下载的序列用BioEdit软件比对分析，确定序列两端保守区域；c、在确定的保守区域用引物设计软件Primer Premier 5设计多对引物并合成；d、提取帘蛤科贝类DNA，然后将合成的引物在相应反应体系下进行PCR扩增；e、进行琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出条带单一、扩增效率高的一组鸡尾引物，此组鸡尾引物由一对兼并引物和一对普通引物组成，其正向引物为COIF-VLT：ACAAAT CAY AAR GAY ATY GG和COIF-VSA：ACC AAT CAT AAA GAT ATT GG，反向引物为COIR-VP：CCT GTA GGA ATA GCA ATA AT和COIR-VJ：CCW GTW GGR ACA GCA ATA AT。

本发明根据包括帘蛤科贝类在内的贝类物种COI序列变异度高和COI通用扩增引物在此动物类群中扩增效率低的特性，通过反复试验筛选出帘蛤科COI基因的特异性扩增引物。采用本发明的帘蛤科线粒体COI基因扩增引物，可以有效的扩增出帘蛤科不同物种的COI序列，对于基于COI分子序列的帘蛤科物种分类、系统发育、系统地理学研究和帘蛤科种质资源保护以及渔业资源管理都具有及其重要的意义。

具体实施方式