[发明专利]一种超声辅助农杆菌介导的植物in planta遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明属于植物转基因领域，更具体涉及一种超声辅助农杆菌介导的植物in planta遗传转化的转基因方法，适用于油菜、芝麻、大豆、拟南芥等大部分作物的转基因。

背景技术

随着DNA重组和植物组织培养技术的发展，分子育种已成为植物育种的一个重要研究领域。植物分子育种即基因工程育种，经过多年的科学实践已发展建立了一整套有别于传统植物遗传育种的、切实可行的外源基因（DNA）转化、筛选和鉴定的技术。由于它可以打破物种间遗传物质横向转移的壁垒，创造出新的作物品种，因此为作物品种改良开辟了一条更为直接有效的途径。基因工程育种方法可分为3类：直接基因导入法（通过物理或化学方法引起）和载体介导法（即将目的基因插入到农杆菌质粒或病毒DNA 分子上，随着载体DNA 的转移而将目的基因导入植物基因组）以及第三类种质系统法（花粉管通道法、生殖细胞浸染法、胚囊和子房注射法等）。以上方法获得的转基因植株多数通过组织培养途径获得，且转基因后代所形成的细胞无性系变异较大，遗传稳定性差，植株再生频率低。

    为了解决再生培养体系等问题，1993年，Bechtold等发明了截然不同于离体方法的in planta转化法，研究发现将活体拟南芥植株浸泡在农杆菌菌液的同时将菌液和植株进行抽真空处理，可明显提高基因的转移频率，转化率达到0.4%。（Bechtold N., Ellis J. and Pelletier G. In planta Aarobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C.R. Acad Sci Paris,  Life Sci., 1993, 316:1194-1199）。In planta法是以生物自身的种质细胞为媒体，特别是植物生殖系统的细胞(花粉，卵细胞，子房，幼胚等)，将外源DNA导入完整植物细胞，实现遗传转化的基因导入技术，称之为种质转化(germ line transformation)，也称为整株活体转化(in planta transformation)或植物原位转化（闫新甫主编.转基因植物.北京:科学出版社,2003）。In planta方法有多种: vacuum infiltration，floral-dip，spraying，点滴微管法等。近年来，floral-dip转化法（花序浸渍法）是拟南芥功能基因研究中广泛采用的一种In planta转基因方法。Feldmann和Marks（Feldmann K.A. and Marks M.D., 1987, Agrobacterium-mediated transformation of germinating seeds of Arabidopsis thaliana: a non-tissue culture approach. Mol. Gen. Genet., 208:1-9）最先在拟南芥中应用原位渗透法获得了转基因成功。Chang等（Chang S.S., Park S.K. and Nam H.G., 1990, Transformation of Arabidopsis by Agrobacterium inoculation on wounds, Plant J., 5(4):551-558）利用摘下的幼嫩花序和受伤的拟南芥植株进行农杆菌接种感染获得转基因植株，但遗传转化率相对较低，而且遗传转化不稳定。Clough和Bent（Clough S.J. and Bent A. Floral-dip: a simplified method for Agrobacteruim-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J., 1998, 16:735-743）用拟南芥作为受体用表面活性剂silwet-77取代抽真空处理，通过floral-dip转移基因获得成功。Floral-dip转移外源基因的最大优点在于能直接获得转化的种子，避免了烦琐的组织培养和继代培养，并且基因转化频率高，一般在0.5%-1%（转基因成功种子与收获种子之比），且转基因后代遗传稳定（刘凡,王国英,曹鸣庆.2003,农杆菌介导的植物原位转基因方法研究进展,分子植物育种,1(1):108-116）.据报道In planta转基因方法已成功应用于苜蓿，白菜和萝卜中，在油菜中已有初步应用（Trieu A.T., Burleigh S.H., Kardailsky I.V., Maldonado-Mendoza I.E., Versaw W.K., Blaylock L.A., Shin H., Chiou T., Kataki H., Dewbre G.R., Weigel D., and Harrison M.J., 2000, Transformation of Medicago Truncatula via infiltration of seedlings or flowering plants with Agrobacterium, Plant J., 22(6):531-541; Somers D.A., Samac D.A., and Olhoft P.M., 2003, Recent advances in Legume transformation, Plant Physiol., 131:892-899; Curtis I.S., and Nam H.G., 2001, Transgenic radish(Raphanussativus L. longipinnatus Bailey) by floral-dip method-plant development and surfactant are important in optimizing transformation efficiency, Transgenic Research, 10:363-371; Cao M.Q., Liu F., Yao L., Bouchez D., Tourneur C., Li Y., and Robaglia C., 2000, Transformation of Pakchoi (Brassica rapa L.ssp.chinensis) by Agrobacterium infiltration, Mol. Breed., 6:67-72;徐光硕,饶勇强,陈雁,张椿雨,孟金陵,2004,用in planta方法转化甘蓝型油菜,作物学报,30(1):1-5），但转化频率仍然不高。芝麻作为世界上重要的油料作物之一，其组织培养研究较其他主要作物落后，组织培养再生比较困难（RAMR et al. Sesame: New approaches for crop improvement[C] //: JANICK J, SIMON J.E.(eds). Advances in New Crops: Timber Press, Portland, 1990:225-228. BEATRICE et al. In vitro regeneration of sesame( Sesamum indicum L.) from seedling cotyledon and hypocotyl explants[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 2006, 85: 235-239），从而制约了芝麻再生技术体系的建立，极大地阻碍了芝麻细胞工程和遗传转化的深入研究，滞缓了芝麻生物技术育种的步伐。虽然研究者们在芝麻离体培养方面进行了较多的尝试，但相关研究报道不多. 2010年7月，Manju Yadav等才首次成功报道了利用农杆菌介导的芝麻遗传转化方法，转化频率也仅为1.01%（Manju Yadav, Darshna Chaudhary, Manish Sainger, Pawan K. Jaiwal, 2010, Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation of sesame (Sesamum indicum L.), Plant Cell Tissue and Organ Culture, DOI 10.1007/s 11240-010-9791-8）。芝麻组织培养研究的整体水平较低，且已有的研究结果重复性较差， 尚未形成一套通用的或具有突破性的高频率再生培养体系（孙建,张秀荣.芝麻组织培养研究进展与展望.山地农业生物学报.2009,28(1):72-78）。利用In planta植物遗传转化法，能直接获得转化的种子，避免了烦琐的组织培养和继代培养，同时为一些不易建立遗传再生体系的作物类型提供了基因转移的新途径，而且在拟南芥上的研究结果还表现出对基因型的不敏感性，一些应用其它方法转化率低的生态型，也能够获得较高的转化频率。（Mysore K S, Kumar C T, Stanton B G. Arabidopsis ecotypes and mutants that are recalcitrant to Agrobacterium root transformation are susceptible to germ line transformation. The plant Journal, 2000, 21(1):9-16）。但是此法在模式植物上的应用较多，其他作物上较为少见，有的甚至尚未成功，且有效性不高。当前，技术难点的攻克和空白薄弱领域的深入研究是影响高效稳定转基因植物研究取得突破的关键问题之一，因此有必要建立和发展多种植物遗传转化方法。