[发明专利]一种基于PCR的DNA标签文库构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及DNA文库构建技术领域，特别是DNA标签文库构建技术领域，特别是基于PCR的DNA标签文库构建方法。另外，本发明还涉及标签技术，以及实现多个样品在同一反应体系中进行文库构建的方法。本发明的方法特别适用于第二代测序技术，尤其是solexa测序技术。

背景技术

Illumina公司提供的Solexa DNA测序平台，可在一个反应中同时加入四种带荧光标记的核苷酸，采用边合成边测序(Sequencing BySynthesis，SBS)，具有所需样品量少，高通量，高精确性，拥有简单易操作的自动化平台和功能强大等特点[1-4]。文库构建首先需要将目的片段进行末端修复，在目的片段的3’末端连接“A”碱基，将3’末端带有“A”碱基的目的片段与DNA接头(也称为adapter)连接，通过PCR反应将目的片段进行扩增，最后回收含有DNA接头的目的片段文库，见图1。目的片段文库与测序芯片上面的DNA接头进行杂交，通过桥式PCR进行扩增后，最后边合成边测序。在每个循环过程里，荧光标记的核苷和聚合酶被加入到单分子阵列中。互补的核苷和核苷酸片断的第一个碱基配对，通过酶加入到引物上。多余的核苷被移走。这样每个单链DNA分子通过互补碱基的配对被延伸，针对每种碱基的特定波长的激光激发结合上的核苷的标记，这个标记会释放出荧光，最后收集到的荧光信号来翻译成碱基序列。目前这种DNA建库方法可以根据需求运用于各种研究领域，如基因组的De Novo测序，基因组重测序、转录组测序和表观基因组测序等。

基于上述建库方法illumina公司也推出了DNA标签(也称为index)建库方法，如图2所示。在DNA标签建库流程中，PCR过程使用了3条PCR标签引物，通过PCR导入标签来构建DNA标签文库[5]。专利申请WO2005068656A1和WO2008093098A2中公开了一种使用标签序列标记核酸样品的来源从而可以将样品进行混合测序的方法，可以通过PCR的过程将特定的核苷酸序列(即标签序列)通过PCR导入到文库中，PCR标签引物序列见表1。这些带有标签的文库可以根据需求进行任意混合，然后通过solexa测序仪器进行测序，最后将数据按标签标签序列进行分类。

但是illumina公司提供的标签文库制备的方法存在着一些缺陷：第一、目前illumina公司只提供12个长度为6bp的标签序列，标签的数量较少，随着solexa测序通量的增加，不能对大量样本进行混合测序将是一个巨大的缺陷；第二、目前illumina公司提供的标签建库方法是通过PCR反应将标签序列导入到目的片段文库中，需要3条PCR引物对目的片段进行扩增(两条公用引物和一条PCR标签引物，如表1)，而且PCR扩增效率不高。

第三、illumina公司提供的标签建库方法中接头不包含标签序列，每一个标签文库需要通过一个PCR反应来导入标签序列，然后针对每一个标签文库都需要切胶回收，然后将切胶回收后的标签目的片段文库进行混合，这样不仅费时费力，而且费用也较高。

因此，对标签的序列及标签引入方法进行优化和改进，使标签引入的效率提高，扩大标签序列的数量，才能满足高通量的建库的要求，以适应测序通量不断提高的现状，使测序仪器的产能充分利用，降低测序的成本。

表1illumina公司提供的标签序列及相对应的PCR标签引物序列

发明内容

基于目前illumina公司的solexa测序平台提供的DNA标签文库制备方法，本发明改良了标签序列，分别设计了长度为8bp独特的标签序列，可以分别通过PCR反应导入标签序列，成功的建立了DNA标签文库的建库方法，并应用于solexa DNA测序，提高了DNA标签文库的制备的效率，增大了DNA样品的测序通量，降低了单个样品的solexa测序费用。

标签设计首先需要考虑标签序列之间的可识别性和识别率的问题，然后需要考虑标签序列混合之后的每个位点的GT与AC碱基含量的平衡问题，最后考虑数据产出的可重复性和准确性。在设计标签的过程中，本发明充分考虑到以上几个因素，同时避免了标签的核酸序列出现3或3个以上连续的碱基，这样可以降低序列在合成过程中或测序过程中的错误率。同时尽量避免标签引物自身形成发夹结构，而导致PCR反应扩增效率的降低。