[发明专利]固定化酶膜的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种固定化酶的制备方法。

背景技术

固定化酶是用一定的材料将活性酶束缚或限制于一定的区域内，但仍能进行酶所特有的 催化反应，并可回收及重复使用的一种新技术。与水溶酶相比，固定化酶在保持其高效、专一 、温和及酶的活性可调节控制等酶催化反应特性以外，还有分离回收容易、可重复多次使用 、操作连续及可控、工艺简便等系列优点，因此在生物及生物工程、医药、食品、医学及生 命科学等相关领域得以迅速发展。

从上世纪50年代膜分离技术进入工业化以来，经过几十年的发展，它已广泛渗透到化工 、冶金、环保、生物工程领域。分离膜不仅能够对气体、有机物、各类生物制剂等进行有效 的分离、浓缩和纯化，而且还成为了固定化酶的载体。固定化酶膜能够将酶的催化特性和膜 的优良分离性能有机地结合起来，从而构成酶膜生物反应器。微孔膜是具有无数互通微孔( 孔径一般为0.01～10μm)的薄膜，其基材可为聚烯烃、聚醚矾、聚氨醋等。在上述基材中， 聚丙烯具有高熔点、高耐热性等优异性能，且聚丙烯材料价格低廉，因而聚丙烯材料制成的 微孔膜得到了广泛应用。现有利用聚丙烯材料制作固定化酶膜制作方法有物理法和化学法俩 大类，物理法的优点在于酶不参加化学反应，整体结构保持不变，酶的催化活性得到很好保 留，但是，该方法制作得到的固定化酶膜上的酶蛋白的承载量较低，仅为15mg/g膜左右，酶 蛋白的承载量较低，影响了固定化酶膜的使用；化学法是将酶通过化学键连接到天然的或合 成的高分子载体上，使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来，而形成相对分子量更大、不 溶性的固定化酶的方法，但是，该法在制作过程对酶活性基团破坏严重，极大的降低了酶的 催化活性，该所制作得到的固定化酶膜催化活性低，极大的限制了固定化酶膜在实际中的应 用。

发明内容

本发明是为了解决现有方法制作得到的固定化酶膜的酶蛋白承载量低以及催化活性低的 问题，而提供了固定化酶膜的制备方法。

本发明固定化酶膜的制备方法按照以下步骤进行：一、聚丙烯膜在丙酮中浸泡22～26h ，然后在25～35℃条件下干燥22～26h后放入浓度为0.2mol/L二苯甲酮的丙酮溶液中，在氮 气保护下用紫外光照射14～16min，紫外光照射强度为90～110μW/cm²，照射距离11～13cm， 再将膜自然晾干后浸入质量浓度为10％～30％的甲基丙烯酸甲酯的乙醇溶液中，在28～32℃条 件下水浴振荡22～26h，然后在28～32℃的条件下真空干燥22～26h即得到甲基丙烯酸甲酯接 枝膜，其中甲基丙烯酸甲酯的乙醇溶液的溶剂是质量浓度为90％～99％的乙醇；二、甲基丙烯 酸甲酯接枝膜浸入到质量浓度为13％～17％的己二胺溶液中，在45～55℃条件下振荡35～ 45min后用去离子水清洗得到了吸附有己二胺的甲基丙烯酸甲酯接枝膜；三、4.5～5.5g的地 衣芽孢杆菌碱性蛋白酶或4.5～5.5g的转谷氨酰胺酶溶解于480～520ml、浓度为0.05mol/L、 pH为6.0的磷酸盐缓冲溶液中得到地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶溶液或转谷氨酰胺酶溶液，然后 将吸附有己二胺的甲基丙烯酸甲酯接枝膜浸入到地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶溶液或转谷氨酰胺 酶溶液中，在3.8～4.2℃条件下反应23～25h，用浓度为0.05mol/L、pH为6.0的磷酸盐缓冲 溶液清洗后即得到了固定化酶膜。

本发明以聚丙烯微孔膜为载体，采用紫外光照射引发接枝甲基丙烯酸羟乙酯的固定化方 法对地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶和微生物转谷氨酰胺酶进行固定化。本实施方式中所使用的甲 基丙烯酸羟乙酯的结构为：

，由于甲基丙烯酸羟乙酯的结构中含有多个羟基，在紫外光照射后可以给后续的酶的固 定化提供了更多的结合位点，且在酶固定化过程中添加了多羟基化合物作为保护剂，大大减 弱了戊二醛对酶活性基团如羧基和丝氨酸羟基等的破坏作用，大大提高本发明的固定化酶膜 的酶蛋白承载量，保证了酶的催化活性不变。本发明制作得到的固定化酶膜的地衣芽孢杆菌 碱性蛋白酶的承载量大于35mg/g膜，谷氨酰胺酶的承载量大于20mg/g膜，与现有方法相比较 蛋白酶承载提高了10％以上，本发明制作得到固定化酶膜的酶蛋白承载量高，且本发明方法 制作得到的固定化酶膜催化活性好，与现有方法制作得到的固定化酶膜相比较本发明制作得 到的固定化酶膜的催化活性提高了20％左右，本发明方法制作得到的固定化酶膜的吸附能力 以及热稳定性好。