[发明专利]猪传染性胸膜肺炎PCR诊断试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种试剂盒，尤其是一种猪传染性胸膜肺炎PCR诊断试剂盒。

背景技术

猪传染性胸膜肺炎(Porcine Contagious Pleuropneumoniae，PCP)是胸膜肺炎放线杆 菌(Actinobacillus Pleuropneumoniae，APP)引起的猪呼吸道疾病，以出血性、坏死性肺 炎和慢性纤维素性胸膜肺炎为特征，该病可引起猪死亡或生长缓慢，给世界各地的养猪业造 成巨大的经济损失(Sebunya T N K等，1983，Macinnes J L等，1988，Gram T等，2000) 。80年代在我国开始流行，近年来形成广泛的流行并且成上升趋势。根据是否依赖NAD可分 为生物I型和生物II型两个生物型。生物I型中的1、5、9、10等血清型致病力最强。据统计 ，我国流行的血清型为1、2、3、5、7、10等型，以1、3、7型为主，主要血清型缺乏交叉 免疫性。现在缺少一种能对临床样品的猪传染性胸膜肺炎进行简便、快捷、灵敏、准确的检 测的试剂盒。

发明内容

本发明的目的是：提供一种猪传染性胸膜肺炎PCR诊断试剂盒，它可以在快速检测到猪 传染性胸膜肺炎，并且简便、灵敏、准确。

本发明是这样实现的：猪传染性胸膜肺炎PCR诊断试剂盒，它包括400μL浓度为20mg/mL 的蛋白酶K，1000μL裂解液，1500μL的TE缓冲液，250μL的PCR酶，170μL超纯水，50μL 的Marker DL2000，40μL等体积混合的引物P1、P2，引物P1、P2的浓度均为20μM，20μL阴 性对照以及20μL阳性对照。

裂解液为由Tris-HcL50mM、EDTA2mM、NaCl100mM以及占裂解液总体积5％的SDS组成的混 合溶液。

TE缓冲液包括Tris-HcL100mM及EDTA1mM组成的混合溶液，混合溶液的PH值为8.0。

PCR酶的组成包括10mM的Tris-HcL、50mM的KCL、1.5mM的MgCL₂以及0.05U的 Poymerase/uL。

引物P1、P2的序列分别为P1：5’-ATGAGGATTTGTTTCTCGGTGGTG-3’，P2：

5-TATTTCCGTCCGGTTTATTCAGGTC-3。

阴性对照为超纯水。

阳性对照为重组pMD18-T-apxIVA质粒。

PCR方法的建立

PCR反应在50μL反应体系中最佳反应条件为，退火温度55℃，Taq DNA polymerase1U ，引物浓度20μmol/L用引物均有效扩增出了其目的片段，片段大小为600bp，无非特异性片 段产生(见图1)。结果表明APP的PCR检测方法建立成功。

敏感性试验

在PCR反应中，5CFU/mL～5×10⁷CFU/mL稀释的APP细菌进行PCR，APP的最低检测量为 50CFU(见图2)。结果表明建立的PCR敏感性高。

特异性试验

以APP1～10型、金黄色葡萄球菌、链球菌、多杀性巴氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、副猪嗜 血杆菌、大肠杆菌进行PCR反应。APP1～10型均为阳性，而金黄色葡萄球菌、链球菌、多杀 性巴氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、副猪嗜血杆菌、大肠杆菌的扩增结果均为阴性(见图3)。 结果表明建立的PCR特异性强。

应用建立的PCR方法，重复检测APP DNA样品3次，结果均一致。

从实验结果可以知道猪传染性胸膜肺炎放线杆菌PCR检测试剂盒能够对APP的临床样品进 行快捷、灵敏、准确的检测。

由于采用了上述技术方案，本发明通过对PCR反应条件进行优化，研制了检测猪传染性 胸膜肺炎放线杆菌PCR试剂盒，通过PCR检测结果与阴性对照及阳性对照比较，可以得到检测 结论，从而起到快速检测样品是否含有猪传染性胸膜肺炎的目的。本发明检测结果准确，并 且快捷、灵敏，检测方式简单，使用效果好。

附图说明

附图1为APP的PCR试验图；

M：DL2000；1：APP PCR结果；

附图2为PCR敏感性试验图；

M：DL2000；1～7：5CFU/mL～5×10⁷CFU/mL稀释的APP PCR结果；