[发明专利]FR-008聚酮抗生素生物合成相关的基因簇

说明书

本发明是由专利申请号为：200310108110.1，专利申请名称为：“负责FR-008聚酮抗生素生物合成的基因簇”，专利申请人为：上海交通大学、韩国高等科学技术学院，专利申请日为：2003年10月23日的专利分案申请。

技术领域

本发明涉及的是一种聚酮抗生素及其生物合成基因，特别是一种链霉菌FR-008中多烯聚酮合酶基因簇，属于生物技术基因领域。

背景技术

抗生素是由微生物、植物和动物等产生的，能够在很低浓度下就可以杀死或抑制其它生物生长的次级代谢产物。如微生物所产生的青霉素、作为抗癌药物的紫杉醇(taxol)等。抗生素通过干扰靶细胞的一个或多个生理代谢过程而发挥作用。聚酮是一类自然产物，很多聚酮类抗生素已应用于医用，兽用及农用，包括红霉素(抗菌)，制霉菌素(抗真菌)，阿维菌素(抗寄生的)，纳巴霉素(免疫抑制剂)和道诺红菌素(抗肿瘤)。革兰氏阳性菌链霉菌是聚酮抗生素的主要产生菌。聚酮的合成与脂肪酸的合成类似，都是经由聚酮合酶介导的简单羧酸单位的缩合过程，而且与聚酮抗生素合成相关的合成基因，调节基因及抗性基因在细菌基因组中往往紧密连锁，成簇排列。负责红霉素大环内酯形成的DEBS聚酮合酶是第一例被发现具有模块结构。随着越来越多大环内酯聚酮的分离与鉴定，它的模块化核心概念始终没有发生改变。I型聚酮合酶的模块结构包括重复的酮基合成酶结构域(KS)，酰基转移酶结构域(AT)，酰基载体蛋白结构域(ACP)(也可能包含酮基还原酶结构域(KR)，脱氢酶结构域(DH)，烯酰还原酶结构域(ER))，每个模块负责聚酮链延伸的一次反应，它们决定着加入的延伸单位的还原步骤。此外，还需要硫酯酶(TE)结构域的作用催化聚酮链的环化与释放。最后，还要经过糖基化、羟基化、甲基化和酰基化等修饰步骤。例如免疫抑制剂FK506通过抑制T细胞激活与生长所需的信号传导途径来阻碍免疫应答。FK506被用来防止移植排拒反应。并被用于某些自动免疫疾病的治疗。在结构上，FK506也是一个大环内酯，可由一些链霉菌产生。

聚酮生物合成PKS的模块结构组成具有一定的可塑性，使得人们能够通过改变模块的数目、延伸模块的特异性或结构域的插入或失活等基因工程操作获得新的聚酮衍生物。

天然大环内酯抗生素多样性的一个重要资源是中心配基特定位点上所结合的糖基。这些糖基组分被发现几乎均与抗生素和其细胞内作用对象之间分子识别有关。许多天然存在的生物活性代谢物携带有不寻常的糖基，作为生物活性分子识别的要素。近来，对于糖苷转移酶及其它糖基合成基因的深入了解越来越多地被用来产生新型糖基杂合的抗生素。糖苷转移酶对底物的一定适应性使糖苷转移酶成为组合生物合成的引人注目的工具。

氨基海藻糖基团存在于很多大环内酯抗生素分子中，大部分多烯抗生素分子携带这种特殊的氨基海藻糖基团。预测的氨基海藻糖合成途径包括来自主代谢中的GDP-甘露糖在GDP-甘露糖脱水酶的作用下转化为GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖，然后异构化为GDP-3-酮基-6-脱氧-D-甘露糖，最后通过GDP-酮糖转氨酶的转氨作用形成GDP-氨基海藻糖。其中异构化可能并不需要酶的参与。

天然抗生素的另一个重要特点是已合成好的中心配基特定位点上可经过氧化酶的后修饰而获得很大范围的结构特征。这些氧化酶介导的后修饰包括羧基化，羟基化，环氧化等。大多数情况下这些后修饰步骤导致产生药效团特性。因而这些后修饰氧化酶基因具有很大的化学和药理学重要性。在组合生物合成中，这些后修饰的氧化酶基因扮演着重要的角色。考虑到聚酮化合物后修饰蛋白在生物活性及结构多样性方面的重要作用，更加广泛的后修饰氧化酶基因可以得到应用并扩大可应用后修饰酶的工具箱。近来，对于后修饰氧化酶基因的深入了解越来越多地被用来产生新型的杂合的抗生素。后修饰氧化酶基因对底物的一定适应性也使其成为组合生物合成的引人注目的工具。

聚酮细胞色素P450单氧化酶催化前体聚酮位点特异性氧化而得到最终的大环内酯抗生素，包括红霉素，泰乐菌素，竹桃霉素，阿维菌素等。这些聚酮细胞色素P450单氧化酶的作用底物以及在相同底物的作用位点都有很大的不同。底物结构的微小变化就会给这些氧化酶作用活性造成很大影响。

另一方面，一直以来，提高产量是抗生素工业生产致力于解决的优先问题。然而，传统的通过改善发酵条件，或通过化学诱变筛选产量提高的抗生素产生菌越来越受到限制，并且很容易达到饱和。随着生物技术的发展特别是基因工程的飞速发展，提供了通过改造抗生素产生菌中相关基因而大幅度提高抗生素产量的途径。这其中增加正调节基因拷贝数或打断负调节基因是最重要的途径之一。