[发明专利]源于BCap37的乳腺癌耐药细胞株及其应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及两株源于同一亲代细胞BCap37的乳腺癌耐药细胞株及其应用。

(二)背景技术

恶性肿瘤是目前包括中国在内的世界上许多国家最主要的致死原因之一(CA Cancer J Clin.2005，55：74-108.)。世界卫生组织(WHO)在美国亚特兰大召开的2008年国际肿瘤学年会上提出警告，到2010年癌症将取代心血管病成为世界死亡人数最多的疾病。我国卫生部统计资料显示，我国每年新增肿瘤患者160～170万，现有肿瘤患者总数约450万，居致死疾病的首位。化疗是全世界目前治疗肿瘤的主要手段之一，尽管不断研制出新的化疗药物，也不断应用新的化疗方案，但是恶性肿瘤获得性耐药导致最终治疗失败。肿瘤耐药机制十分复杂，不同的耐药逆转机制之间又存在错综复杂的关系。多药耐药(multidrug resistance，MDR)是其中的重要机制。多药耐药是肿瘤细胞免受外来有害物质损伤的自身防御机制，是指肿瘤细胞对一种化疗药物产生抗药性的同时也对其它从未接触过的、结构和作用机制完全不同的抗肿瘤药物产生抗药性。许多天然来源的抗肿瘤药物如紫杉醇类、长春新碱类，蒽环类等会诱导肿癌细胞产生MDR。

ATP结合盒膜转运蛋白超家族(ATP-binding cassette，ABC)具有ATP依赖性的药物外排泵功能，能将药物泵出细胞膜外而降低胞内药物浓度，是目前MDR的主要机制。其中P-gp蛋白(P-glyeoprotein，P-gp)是目前研究较广泛的耐药机制。1976年，Juliano和Ling在具有MDR表型的中国仓鼠卵巢细胞上发现一种跨膜糖蛋白，是分子量为170KD的跨膜磷酸糖蛋白(Biochim Biophys Acta，1976，455(1)：152-162.)。肿瘤细胞膜上的P-gp过度表达，化疗药物与其结合后，导致ATP结合区活化，ATP水解释放能量，在Mg2+的作用下使P-gp形态发生变化，在药物尚未发生细胞毒作用时，即将其泵出细胞外，降低了细胞内药物的浓度，使得细胞免受化疗药物的毒性作用而产生了MDR(Biochem Pharmacol，2002，64(5-6)：943-948.)。目前研究发现人类几乎所有肿瘤细胞中均可检测到MDR1基因，在结肠癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、神经母细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、食管癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、胆囊癌、胆管癌等癌肿中，P-gp均有不同程度的表达。耐药细胞依据P-gp表达与否，分为P-gp依赖型和非P-gp依赖型。

通过耐药细胞株的建立可以进一步构建体内外肿瘤耐药模型，从而深入研究MDR耐药机制，甚至发现其他新的耐药机制。2004年Yi Wang等人曾报道了通过转染mdr1基因构建的高度表达P-gp的Bcap37细胞。亲代Bcap37细胞和高表达P-gp的Bcap37耐药株可用于P-gp底物的筛选及作为研究药物生物学分布和药物动力学的模型(World Journal ofGastroenterology 2004，10(9)：1365-1368)，但这是在BCap37细胞中导入外源性的MDR1基因，具有一定的局限性。Masashi Takeda等筛选出耐紫杉醇的DU145和PC-3细胞株，并用表观遗传学和DNA芯片技术分析其潜在的分子耐药机制(The Prostate 2007，67：955-967)，但只得到了P-gp依赖型的耐药细胞株。

(三)发明内容

本发明目的是提供两株源于同一亲代细胞BCap37的P-gp依赖型和非P-gp依赖型的乳腺癌耐药细胞株及其应用。

本发明采用的技术方案是：

一种非P-gp依赖型乳腺癌耐药细胞株bast72，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏日期：2010年8月17日，保藏编号：CCTCC No：C201065。

一种P-gp依赖型乳腺癌耐药细胞株bads200，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏日期：2010年8月17日，保藏编号：CCTCC No：C201066。

本发明细胞株采用改创的“两阶筛选法”获得，其中Bats-72通过依赖于紫杉醇高剂量冲击时间递增的“两阶筛选法”获得，Bads-200通过依赖于紫杉醇剂量递增的“两阶筛选法”获得。“两阶筛选法”分为耐药性适应阶段和巩固阶段。在适应阶段注重于让肿瘤细胞逐渐适应于药物(如紫杉醇)刺激，并不断地扩增药物处理后的存活细胞；而在巩固阶段则是通过加强药物刺激强度，对逐渐适应于药物刺激存活细胞的耐药性状进行巩固。