[发明专利]一种腺苷甲硫氨酸的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及腺苷甲硫氨酸的酶促合成制备方法，具体涉及用固定化的腺苷甲硫氨酸合成酶催化合成制备腺苷甲硫氨酸，属于生物制药领域。

背景技术

中国是人口大国，同时也是“肝炎大国”。据1992年全国病毒性肝炎流行病学调查，全国约有1.2亿人携带乙型肝炎病毒，丙型肝炎在一般人群中感染率为3.1％。我国现有2000万例慢性乙型肝炎患者，其中部分有可能转化为肝硬化，甚至肝癌。

腺苷甲硫氨酸(SAMe)是人体内一种极为重要的中间代谢产物。它可以通过转硫途径生成体内关键的抗氧化及解毒物质——半胱氨酸，再生成另一种关键的抗氧化和解毒物质——谷胱甘肽，解除肝内的氧化物应激状态，从而达到防治肝病的目的。另外SAMe还可以促进依赖性脂磷脂的合成，降低胆固醇和磷脂的比例，恢复细胞膜的流动性，促进胆汁的主动转运和甘油酸三脂的分泌。因此SAM对肝内胆汁郁积、各种急、慢性肝炎以及脂肪肝、肝硬化等肝脏疾病有很好的疗效。SAMe于20世纪80年代出现在欧洲医药市场上，1999年美国FDA正式批准SAMe上市，使其迅速成为畅销的营养保健品之一，年销售额超过10亿美元。由于其疗机理清楚、效显著、起效快、副作用小，近年来在国内的需求量也越来越大，有广阔的市场前景。

目前，SAMe的生产方法主要有化学合成法、发酵法和酶促转化法3种。

化学合成法采用S一腺苷同型半胱氨酸(S-adenosythomocysteine)和甲基供体(CH₃I)合成，腺苷甲硫氨酸有(R，S)和(S，S)两种构型，只有(S，S)构型才有生物活性，但合成产物中含有大量(R，S)腺昔甲硫氨酸，且难以分离，合成产率也低。

发酵法采用在培养基中添加L-甲硫氨酸，用酵母发酵生产(一)型腺苷甲硫氨酸，是60年代至80年代生产腺普甲硫氨酸的主要方法，但发酵法的缺点是终产物积累量低、原料转化率低、产品生产周期长以及SAM的纯化工艺复杂等，从而导致了腺苷甲硫氨酸的价格居高不下，限制了SAM的广泛生产机应用。

酶促转化法主要利用腺苷甲硫氨酸合成酶催化底物L一甲硫氨酸和ATP生成(一)型腺昔甲硫氨酸。酶作为生物催化剂具有快速、专一的特点，因此酶促转化法生产腺苷甲硫氨酸具有高效、工艺简单、产品生物活性高且无污染的优势。但是，SAMe合成酶在动物、植物和微生物中含量少、酶活低，且分离纯化困难，因此通过酶促转化法生产SAMe受到SAMe合成酶活力的限制，基因工程的发展使获得大量高活性的SAMe合成酶成为可能，利用DNA重组技术构建高效表达SAMe合成酶的基因工程菌，重组菌表达SAMe合成酶活性为野生菌的几十倍到上百倍，经初步分离纯化后的游离酶可用于体外SAMe的合成，但游离酶不稳定，容易失活。

固定化酶技术是近年来发展起来的一项技术，它是模拟体内酶的作用方式，通过化学或无力的手段，用载体将酶束缚或限制在一定的区域内，使酶分子在此区域进行特有和活跃的催化作用，并可回收及重复使用。常用的固定化方法可分为4类：吸附法、交联法、包埋法、共价结合法。理论上，对于游离的酶，通过固定化处理，可以提高酶在体外的稳定性。但是，不同的酶，由于其结构及性质的差异，固定化所选用的方法及载体的不同，其酶活保留率、稳定性及多次使用的酶活回收率等存在很大差别。

中国专利CN101285085A公开了一种重组微生物全细胞催化合成SAMe和利用固定化细胞催化生产SAMe的方法，但由于微生物细胞膜的通透性屏障，使反应底物和产物都难于自由进入细胞，生物催化效率明显低于酶催化反应体系，且由于细胞中，含有其它很多的一些杂酶会利用反应底物(如ATP)，使得其它反应产物也相应增多，后续的纯化工艺也会更为复杂困难。牛卫宁等(牛卫宁，左晓佳，尚晓娅，等.固定化E.Coli JM109(pBR322-MAT)细胞催化合成S-腺苷甲硫氨酸)利用固定化细胞合成S-腺苷甲硫氨酸，在反应八批次后，固定化细胞的酶活性开始下降较为明显，酶活保存仅为最高酶活性的78％。

发明内容

为解决现有技术中利用SAMe合成酶合成SAMe时，SAMe合成酶体外不稳定、容易失活的问题，本发明的目的在于提供一种应用固定化腺苷甲硫氨酸合成酶酶催化合成(S，S)-腺苷甲硫氨酸的方法，该方法生产效率高，产物得率高，且固定化酶经多次使用后，仍有较高的回收率，酶源更稳定。

本发明对SAMe合成酶的固定化方法，可以采用吸附法、交联法、包埋法、共价结合法、包埋-吸附结合法或包埋-交联结合法中的任意一种，将SAMe合成酶固定在固定化载体上。