[发明专利]一种快速简便分析传统酿造用大曲微生物群落结构的方法

权利要求书

1.一种快速简便分析传统酿造用大曲微生物群落结构的方法，包括以下步骤：

a)采集用于实验的大曲样品，粉碎混匀；

b)称量一定量a)中的大曲样品，依次加入3.2ml磷酸盐缓冲液、8ml甲醇、4ml氯仿，振荡静置过夜，收集含有脂质的有机相；

c)将步骤b)中获得的有机相经硅胶小柱分离，分别用10ml氯仿、10ml丙酮和10ml甲醇洗脱，收集含有极性脂的甲醇相洗脱液；

d)将步骤c)得到的洗脱液经氮气吹干后加入1ml甲苯∶甲醇((1∶1)v/v)和1ml 0.2mol·l^-1氢氧化钾-甲醇，甲脂化环境为37℃水浴15min；

e)将步骤d)得到脂肪酸甲酯混合液，通过4ml正己烷萃取；

f)将步骤e)得到的脂肪酸甲酯萃取液经氮气吹干，加入含有正十九酸甲酯内标物质的溶剂溶解；

g)将步骤f)得到的溶液进行气相色谱-质谱联用仪的分析测定，得到样品中相关磷脂脂肪酸的分布及含量，气相色谱-质谱联用仪采用的是Thermo Trace GC Ultra DSQ II气质联用仪，检测中使用的升温程序如下：进样口温度：250℃；进样量：0.5μl；分流比：10∶1；载气(He)流速：1ml·min^-1；起始柱温：50℃，保持2min；以5℃·min^-1升至220℃，保持15min；质谱条件：电子强度：70eV；离子源温度：200℃；扫描范围：35～400amu；

h)结合相关的数据处理方法，处理步骤g)得到的数据，确定样品微生物群落特征。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a)中：实验材料可以为任意用途的传统酿造用曲，如：白酒，食醋，酱油，本实验采用的是浓香型白酒大曲及麸醋醋曲。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤h)中：大曲样品微生物群落结构分析方法为微生物标记法，采用特征磷脂脂肪酸作为微生物群落的指标，其中18:2ω6，9，18:3ω6，9，12，19:1ω9是用于表征真菌的特征脂肪酸；10Me15:0，10Me16:0，10Me 17:0，i1 5:0，a1 5:0，i1 6:0，i17:0，a17:0是表征G⁺细菌的特征脂肪酸；16:1ω5，16:1ω7，16:1ω9，cy17:0，18:1ω5，18:1ω7，cy19:0是表征G^-细菌的特征脂肪酸；16∶0是表征微生物通用的特征脂肪酸，用于估算微生物总量，微生物群落结构分析采用的是主成分分析(PCA)以及聚类分析。