[发明专利]纯化质粒DNA的方法

说明书

本申请为分案申请，原申请的申请日为2005年4月19日，申请号为200580011784.7(PCT/EP2005/005213)，发明名称为“纯化质粒DNA的方法”。

技术领域

本发明涉及核酸纯化的方法。本发明特别涉及制备高度纯化的质粒DNA(pDNA)的方法，特别涉及生产和分离药物级质粒DNA。

背景技术

分子生物学的发展清楚地说明，基于质粒的疗法，尤其在疫苗和人类基因治疗领域中，可能支持有效的疾病治疗途径。但是，对于该技术存在一个显著的障碍，那就是制备数量上和质量上都足以用于临床的质粒DNA。通过质粒DNA来将正常基因安全而有效地导入人类细胞是一种有前景的方法。质粒DNA是一种闭合环状形式的细菌DNA，其中可插入感兴趣的DNA序列。可以导入哺乳动物细胞的感兴趣的DNA序列的例子包括外源的功能基因，或突变基因，反义序列，干扰RNA(RNAi)或双链干扰RNA(dsRNAi)，核酶(ribozymes)，例如在病毒感染，癌症或血管发生相关疾病的治疗中。一旦导入到人类细胞中，pDNA就开始复制并产生被插入的DNA序列的拷贝。因此，科学家们把质粒DNA看作一种有前景的载体，用于将感兴趣的DNA序列传送到人类细胞中以治疗多种疾病状态。

为了在治疗中实施基于质粒的技术，需要极大量的质粒DNA用于研究和开发。由于用于基因治疗和其他临床应用的质粒DNA通常是用细菌例如大肠杆菌(Escherichia coli)生产的，需要有效地将质粒DNA与细菌细胞的基因组DNA(gDNA)及细菌细胞的内毒素和蛋白质分离的方法。由此，对于简单、稳健、可放大、可用来从细菌细胞中分离大量的质粒DNA的纯化方法，存在着不断增长的需求。

在任何质粒纯化方法中都有一个重要的步骤，其包括裂解细菌细胞以释放细胞内容物，从该内容物中可分离pDNA。事实上，首先需要实现细胞重悬、细胞裂解，及宿主污染物的中和和沉淀这三个步骤。细胞重悬一般使用手动或磁力搅拌器，和匀浆器或转叶(impeller)混合器将细胞重悬于重悬缓冲液中。细胞裂解可通过手工旋转或磁力搅拌来将重悬的细胞与裂解溶液(由稀碱和去污剂组成)，然后将该混合物在室温(20-25摄氏度(degrees Celsius))或冰上保持一段时间，例如5分钟，来完成裂解。如上面指出的，手工旋转和磁力搅拌是不可放大的。第三个步骤是宿主污染物的中和和沉淀。第二个步骤生成的裂解物通常通过温和的旋转或磁力搅拌与冷的中和溶液混合以酸化该裂解物，然后置于冰中10-30分钟以便于高分子量的染色体DNA、宿主蛋白质和其他宿主分子变性和沉淀。手工旋转和磁力搅拌都是不可放大的。

通常，通过短时间溶菌酶处理，或通过碱或醋酸钾(KOAc)处理来消化细胞壁。一般还加入RNA酶来降解细菌悬液中的RNA。这些化学性步骤对小规模地裂解细胞可能是足够的。但是，粘度的增加使得大规模的加工非常困难。

一种快速而简单的质粒制备的替代方法包括用溶菌酶处理细菌，然后在合适的缓冲液中约100℃左右煮沸20到40秒，生成不溶的基因组DNA、蛋白质和碎片的凝结块(clot)，留下质粒和作为主要污染物的RNA在溶液中。接着，加入NaOH和十二烷基硫酸钠(SDS)来溶解细胞膜。NaOH部分地变性DNA并部分地降解RNA；SDS起溶解膜和变性蛋白的作用。接着，加入5N醋酸钾(pH 4.8)来沉淀SDS-蛋白质复合物和细胞碎片。此时，pH对于中和上述操作中使用的NaOH和复性质粒都是重要的。此后，离心除去沉淀，得到上清中的目标质粒。但是，该技术不适合放大到高容量的细菌发酵，其原本就是用于小于5升的发酵的。同时，这一系列的操作要求缓慢和稳定地混合以避免细菌染色体DNA被切割成小片段并聚集，使它们污染质粒，并且难以在大规模加工中实现。

一种常用的裂解细胞的替代方法称为碱裂解(alkaline lysis)，其包括(consist of)将细菌细胞悬液(溶液1)和碱裂解溶液(溶液2)混合。溶液2包括去污剂，例如十二烷基硫酸钠(SDS)，用于裂解细菌细胞并释放细胞内物质；和碱，例如氢氧化钠，用于使细胞的蛋白和核酸(特别是gDNA和RNA)变性。由于细胞裂解和DNA变性，溶液的粘度急剧升高。变性后，加入酸性溶液，例如醋酸钾(溶液3)以中和氢氧化物，导致核酸的变性。gDNA的长片段随机地重新结合形成网状结构，其以絮凝物的形式沉淀，并捕获蛋白，脂类及其他核酸。十二烷基硫酸的钾盐也沉淀，并带走与其结合的蛋白。pDNA(质粒DNA)互相缠绕的两条链正常地重新组合，恢复为初始的质粒，并保留在溶液中。