[发明专利]mitf基因敲除剂

说明书

技术领域

本发明涉及一种小眼相关转录因子(microphthalmia-associate transcription factor，mitf)基因的敲除剂，尤其涉及一种针对mitf基因的DNA序列TTTGACTCTTATCAAAGACCTGAT的基因敲除剂。 

背景技术

mitf基因表达一种含有螺旋-环-螺旋的亮氨酸拉链的蛋白质，最初是在小鼠毛色突变体中发现的一种转录因子，与小鼠的毛色、眼睛的发育、破骨细胞和柱状细胞的发育有关。mitf基因在斑马鱼、鸟类、哺乳动物中是同源的，在脊椎动物的色素细胞发育过程中有重要作用。在斑马鱼中，mitfa基因主要在神经嵴起源的色素细胞中起作用，也在视网膜色素上皮细胞中表达。研究mitf基因对于研究色素细胞和破骨细胞的发育有重要意义。 

目前研究基因的功能和信号通路主要是通过反向遗传学技术，所述反向遗传学技术主要有：传统的基因打靶技术，MO(morpholino oligonucleotide)技术、Tilling技术，RNAi，过表达技术等。传统的基因敲除技术已经有20多年的历史，在小鼠中建立了很成熟的技术体系，可以定点敲除基因，但是该技术应用于不同的物种中，需要建立不同物种的胚胎干细胞系，操作复杂，另外由于斑马鱼、果蝇等非哺乳动物很难建立胚胎干细胞系，难于实施该技术。MO技术是一种常见的阻滞斑马鱼基因表达的技术，但是该技术存在以下三个缺点：一是作用的时间很短，只能在胚胎发育的前两三天对基因进行阻滞；二是作用的范围有限，该技术只能对胚胎发育早期启动基因起作用；三是产生的表型不能遗传。Tilling技术是一种可以使基因产生突变的技术，但是该技术费时、费力、而且很难在定点位置进行突变。RNAi技术和过表达技术也只是针对某个基因，在翻译水平改变基因的表达水平，不能得到目的基因缺失的突变体。 

鉴于此，研发简便实用的基因敲除剂，快速定点敲除mitf基因具有重大的应用价值。 

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种mitf基因敲除剂，即针对mitf基因的DNA序列TTTGACTCTTATCAAAGACCTGAT的基因敲除剂。所述mitf基因敲除剂操作简便实用，可以在TTTGACTCTTATCAAAGACCTGAT位点快速定点敲除mitf基因。 

本发明所述的mitf基因敲除剂，包括两种锌指核酸酶(Zinc finger nuclease，ZFN)；其特征在于：所述锌指核酸酶是锌指核酸酶ZFN1和锌指核酸酶ZFN2；其中，锌指核酸酶ZFN1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，锌指核酸酶ZFN2的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。 

上述锌指核酸酶ZFN1包括锌指结构ZF1、Nco I酶切位点(CCATGG)和非特异性切割结构域Fok I-RV，其中ZF1的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，ZF1特异性结合序列为AGACCTGAT。 

上述锌指核酸酶ZFN2包括锌指结构ZF2、Nco I酶切位点(CCATGG)和非特异性切割结构域Fok I-DA，其中ZF2的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，ZF2特异性识别序列TTTGACTCT的互补序列为AGAGTCAAA。 

ZFN1和ZFN2结构大致相同，都包括锌指结构(Zinc finger，ZF)和一个非特异性切割结构域，ZFN1的切割结构域Fok I-RV与ZF2的切割结构域Fok I-DA结合成异元二聚体特 异作用于两端识别序列之间的6个碱基TATCAA，切割出粘性末端，在生物体的修复过程中，通过非同源末端连接修复的方式在这个位点产生永久性突变。 

本发明所述的mitf基因敲除剂的制备主要包含以下三个步骤： 

[1]通过两步法PCR合成锌指核酸酶ZFN1和ZFN2的锌指结构ZF1和ZF2； 

[2]构建两个表达质粒，分别包含锌指核酸酶ZFN1和ZFN2的核酸序列； 

[3]体外表达锌指核酸酶ZFN1和ZFN2，并纯化这两种蛋白。 

本发明所述的mitf基因敲除剂在各种生物的mitf基因定点敲除中的应用： 

本发明所述的mitf基因敲除剂可应用于对斑马鱼、小鼠、鸟类等的mitf基因进行定点敲除，进而可深入研究mitf基因的功能和相关的信号通路。 

本发明所述的mitf基因敲除剂具备的优势是： 

(1)应用范围广，可以在体外培养的细胞、胚胎细胞、个体水平进行。