[发明专利]一种快速制备重组耐热锰超氧化物歧化酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物分离工程与技术领域，具体是应用超大孔金属螯合层析介质快速分离纯化在大肠杆菌中表达的重组耐高温锰超氧化物歧化酶(SOD)的方法，产品纯度达85％以上。 

背景技术

SOD是体内一种重要的氧自由基清除剂，能够平衡机体的氧自由基，从而避免当体内超氧阴离子自由基浓度过高时引起的不良反应，同时SOD是一种很有用途的药用酶。医学界已经证明它具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗缺血、提高人体免疫力等作用(Bioehem J，1991，274：153-158)。目前SOD酶已作为一种保健医药产品广泛应用于医药、食品、饮料、化妆品等行业，具有非常广阔的市场。 

热变性是导致酶失活的常见原因，在实际应用中，SOD的热稳定性是决定其能否商业化的一个主要因素。从极端耐热微生物中克隆SOD基因，然后在大肠杆菌中重组表达，从而制备耐高温SOD成为一个研究热点(Extremophiles，2005，9：1-6；J Mol Biol，270：259-274；JBiochem，1999，126：218-225)。在本发明中我们从嗜热栖热菌Thermus thermophilus HB27中克隆SOD基因，构建重组载体，在大肠杆菌中表达耐高温Mn-SOD。 

目前，从基因工程菌中分离SOD的方法主要有：多级离心分离、双水相萃取、超滤、层析等。然而，多级离心分离、双水相萃取、超滤分离的SOD纯度不高，通常只能得到粗酶制品，作为医药级产品达不到应用标准。层析法虽然能够得到高纯度的SOD，但是现有的生物大分子层析介质均属于软基质(琼脂糖、葡聚糖、纤维素等)，孔径小，分离速度慢，很难进行工业放大。 

美国生物系统公司上世纪90年代开发了一种超大孔聚苯乙烯树脂(J Chromatog，1990，519：1-29)，粒径8-10μm，平均孔径有100nm和400nm两种，被用于反相色谱和离子交换色谱对生物大分子进行快速、高分离度的制备分离。这种超大孔介质机械强度高，传质速度快，有效降低了“停滞流动相的传质阻力”，分离速度比常规介质快10-100倍。但由于微球制备方法复杂，重复性差，近年来少有POROS介质的应用报道。Gustavsson等人依据这一原理(J.Chromatogr.A，1999，830(2)：275-284)，将琼脂糖制成同时具有特大孔和扩散孔的色谱介质，用于生物大分子的分离，分离时间比常规琼脂糖珠体分别快5和3倍。但是由于琼脂糖微球自身属于多糖类软凝胶，机械强度是该微球应用的一个限制因素。目前，在蛋白质等生物大分子分离纯化领域，超大孔介质的应用报道较少，或局限于实验室规模分离模型蛋白，应用于分离纯化耐高温SOD酶的研究还未见报道。 

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单，易于放大的重组耐高温SOD酶快速分离制备方法。 

本发明采取的技术路线是： 

1.以嗜热栖热菌(T.thermophilus HB27)基因组DNA为模板，采用PCR技术克隆SOD基因，PCR产物经EcoR I和Sal I双酶切后，连接到经同样处理的pET28a⁽⁺⁾克隆/表达载体上，产生重组质粒p28ASOD，将重组载体p28ASOD导入大肠杆菌(E.coli)，获得基因重组工程菌E.coli/p28ASOD。 

2.将重组大肠杆菌培养至OD600约为0.6(37℃，250rpm)，加入诱导剂IPTG至浓度为1mM；继续培养8小时。 

3.取步骤2得到的发酵液500ml，离心15min(离心条件为4℃，离心力为1000×g)，用1M的TE Buffer(pH 8.0)5-10ml清洗菌体，再离心15min，弃去上清液，加入1M的TE Buffer(pH 8.0)5ml，混合均匀；用超声波细胞粉碎机对其进行菌体破碎(超声条件：声波时间2s，间隔3s，次数99次)；超声之后离心15min，取上清液备用。 

4.利用超大孔金属螯合介质层析柱对步骤3所得上清液进行上样，洗脱，一步得到目标产品。 

本发明步骤4中所用的超大孔金属螯合介质为自制，平均粒径55μm，孔径300-500nm，金属螯合配基为亚氨基二乙酸(IDA)，金属离子为Ni²⁺，金属螯合量为40μmol/ml介质。