[发明专利]一种适于水稻品种真实性鉴定的ISSR指纹图谱构建方法

权利要求书

1.一种适于水稻品种真实性鉴定的ISSR指纹图谱构建方法，该方法包括DNA提取、ISSR-PCR扩增及电泳检测、DNA指纹图谱构建等内容。

具体包括以下步骤：

(1)DNA提取

以不同水稻品种种子为材料，于苗期取幼嫩叶片采用改进的CTAB法提取DNA，取部分DNA溶液测其浓度，稀释至20ng/μL，于-20℃保存备用；

(2)ISSR-PCR扩增及电泳检测

采用25μL反应体系，Mg²⁺浓度为2.5mmol/L，引物浓度为0.2μmol/L，dNTPs的浓度为0.2mmol/L，DNA用量为40ng，Taq DNA聚合酶的用量为1U；

PCR扩增程序条件为：94℃预变性5min，94℃变性45s，50-56℃退火45s，72℃延伸90s，40个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存；

用1.5％琼脂糖凝胶电泳，Gel-Red染色，检测ISSR-PCR扩增产物，在紫外灯下拍照；

(3)DNA指纹图谱构建

根据每条引物呈现的条带信息建立指纹图谱：以水稻品种编号和扩增谱带带型为纵列，以每条谱带的位点编号为横行，在每一纵横交结处，有扩增谱带用“1”表示，没有扩增谱带用“0”表示，分别制得每条引物对不同品种的DNA指纹图谱表，以24个水稻品种为例，引物UBC 815对24个水稻品种构建的指纹图谱表为：

引物UBC 900对24个水稻品种构建的指纹图谱表为：

(4)利用构建的DNA指纹图谱进行品种真实性鉴定

将待鉴定的水稻品种样品在上述条件下所建立的指纹图谱与已构建的DNA指纹图谱相比较，与所建DNA指纹图谱不同的即为假种子。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述ISSR-PCR扩增中采用的引物是UBC 815和UBC 900。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述DNA指纹图谱是以水稻品种编号、扩增谱带带型编号、每条谱带位点编号及“1”“0”阵列为基本信息，便于检索和鉴定。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：每个DNA指纹图谱表是以单条ISSR引物的扩增谱带信息构建的。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：DNA指纹图谱中，每个水稻品种都有其特异的DNA指纹，能将供试品种逐个鉴别开来。