[发明专利]一种长春花生物碱类活性成分的诱导提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种获得长春碱、长春新碱、长春质碱和文多灵的长春花类生物碱提取物的诱导提取方法，属中药化学领域。

背景技术

长春花是夹竹桃科长春花属一种重要的药用植物，含有多种具有生物活性的生物碱类物质，其中长春碱和长春新碱是治疗霍其金氏病和儿童急性白血病的特效药，是目前国际上应用最广泛的天然抗肿瘤植物提取物之一，在国际市场上很有开发潜力，市场前景十分广阔。我国长春花资源丰富，因此急需开发具有我国自主知识产权的抗肿瘤植物提取物生产工艺，发展国民经济。

传统的提取方法如煎煮法、浸渍法、渗漉法、回流提取及索式提取过程都是在完整植物细胞的情况下，通过浸润与渗透、使溶剂进入组织细胞、溶解细胞内物质并使其扩散至溶剂主体，这使溶剂提取细胞内生物活性成分成为可能。但由于细胞壁的屏障作用，决定了中药材有效成分的提取效率有一定限度。

酶诱导是利用酶(如半纤维素酶、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等)将细胞壁的成分水解或降解，破坏细胞壁结构，使有效成分充分暴露出来，加速有效成分的释放，从而提高提取效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以长春花为原料，采用酶诱导-负压空化提取方法高效地获得富含长春碱、长春新碱、长春质碱和文多灵四种生物碱类活性成分的长春花提取物，从而提高长春花的资源利用度。

本发明的技术方案：新鲜的长春花与酶溶液混合→匀浆→震荡酶解→酶解液抽滤→负压空化提取→抽滤→合并酶解液和提取液→浓缩→溶剂除杂→萃取富集→浓缩至干，即得富含长春碱、长春新碱、长春质碱和文多灵四种活性成分的长春花提取物。具体方案如下：

(1)酶诱导匀浆提取：将新鲜的长春花和浓度为0.3～1.5mg/mL酶溶液按固液比1∶5～15(g∶mL)混合，调节pH值为3.5～6.0，匀浆0.5～2min，然后将匀浆液放入恒温摇床中，在25～50℃酶解8～40h，转速80～120rpm。

(2)负压空化提取：将酶提取液抽滤，固形物加入提取溶剂，固液比为1∶8～25(g∶mL)，室温提取2～4次，每次10～40min，将抽滤后的酶解液和提取液合并，浓缩，得到浓缩物。

(3)溶剂除杂：将浓缩物用水溶解，以等体积的溶剂萃取3～5次。

(4)富集精制：将经过除杂的水相层用等体积的溶剂萃取3～5次。合并萃取液，浓缩至干，得到长春花生物碱类活性成分的提取物。

本发明所述步骤(1)酶诱导匀浆提取过程中所用的酶为纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和果胶酶其中的一种或两种以上的组合。

本发明所述步骤(2)负压空化提取中所用的提取溶剂为醇-水(包括甲醇、乙醇和丙醇)、丙酮-水体系。

本发明所述步骤(3)溶剂除杂中所用的溶剂为石油醚、乙醚、溶剂油、正己烷其中的一种或两种以上的组合。

本发明所述步骤(4)富集精制中所用的溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇其中的一种或两种以上的组合。

按照本发明所述优选的酶诱导负压空化提取条件对长春花中生物碱类活性成分进行高效诱导提取，提取物中文多灵、长春质碱、长春碱和长春新碱四种生物碱类活性成分的含量分别可达到11.30～17.56％，6.52～10.79％，3.10～5.86％，0.98～1.72％，比传统方法对照组提高了10～80％。

本发明的优点：

(1)该方法具有操作条件温和、提取温度低、提取率高的特点。

(2)耗能低，生产成本低，可实现大规模产业化生产。

具体实施方式

实例1

配制纤维素酶浓度为0.3mg/mL调节pH在5.0～6.0之间。称取新鲜长春花200.0g，以固液比为1∶5的比例加入酶液，匀浆粉碎1min，匀浆液放入45℃的恒温摇床中，转速90rpm，震荡酶解24h，抽滤，固形物中以固液比1∶10加入80％乙醇溶液负压空化提取2次，每次25min，合并提取液，浓缩，浓缩物中加入15mL水，用石油醚除杂3次，水相用乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯层，浓缩至干，得到固形物0.65g，甲醇定容，HPLC检测，所得固形物中文多灵、长春质碱、长春碱和长春新碱的含量分别为15.46％、7.93％、3.81％、1.12％，比传统方法对照组提高了17.5％、30.6％、58.6％、53.9％。

对照组采用传统热回流法提取：按照固液比1∶15加入80％乙醇，80℃加热回流两次，合并提取液，浓缩，浓缩物中加入15mL水，用石油醚除杂3次，水相用乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯层，浓缩至干，定容，HPLC检测。

实例2