[发明专利]一种高效转化棘白菌素B的基因工程菌及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，特别涉及一种高效转化棘白菌素B的基因工程菌及其制备方法。

背景技术

在过去的二十多年时间里严重危害人类生命健康的真菌感染，无论是在死亡率以及感染的种类方面都在不断的增加，特别是在免疫抑制病人中。目前用于治疗临床深部真菌感染的主要药物是唑类抗真菌药物和两性霉素B，虽然这两类药物对控制临床深部真菌感染起到了重要的作用，但由于这些药物由于选择性差、耐药真菌的出现、对诸如曲霉和白念珠菌等真菌的敏感性不强等不足，使深部真菌感染疾病的死亡率居高不下。

棘白菌素(Echinocandin)类抗真菌抗生素是20世纪70年代发现的一组天然产物，由相似的环状多肽核心和不同的脂肪酸侧链组成，是临床治疗系统性真菌感染的重要药物。这类抗生素能够非竞争性地抑制真菌细胞壁β-1，3-葡聚糖合成酶的活性。其作用机制独特，毒副作用低，且对一些唑类和两性霉素B耐药的真菌具有很强的抗菌活性，尤其是对诸如曲霉和白念珠菌等呈现上升趋势的真菌具有独特的疗效，是目前临床治疗深部真菌感染的“王牌抗生素”。棘白菌素类抗生素主要有三种类型：B，C和D，其中棘白菌素B(Echinocandin B，ECB)是最主要的类型。ECB，是于1974年NyfelerR.等人发现由曲霉菌属Aspergilus nidulans和Aspergilu rugulosus发酵产生的，但由于酰基侧链的存在，使其具有一定的溶血毒性。以ECB为先导化合物进行结构改造，可以得到一些具有临床应用前景的化合物，如西洛芬净(Cilofungin)、卡帕芬净(Caspofungin，MK991)、米卡芬净(Micafungin，FK463)、阿尼芬净(Anidulafungin，LY303366)。西洛芬净由于毒性和剂型问题终止了研究开发，但后三者已分别先后在美国(2001年)、日本(2002年)、美国(2006年)首次上市。

对ECB进行结构改造，用戊氧-三苯羧基取代亚油酰基侧链即可得到阿尼芬净，而其中ECB的去酰化即其母核的制备是关键步骤。目前对于ECB母核的制备方法中，因化学制备成本较高，因此主要是通过微生物转化——犹他游动放线菌NRRL12052发酵产生的去酰化酶对ECB进行催化的方式得到。微生物转化具有以下优点：反应条件温和、产物单一、高度的化学选择性、区域选择性和对映体选择性、易于纯化、不污染环境且能完成一些化学合成难以进行的反应。但是犹他游动放线菌野生菌株的ECB去酰化酶的产量很低，对ECB的生物转化效率不高。

棘白菌素B(ECB)去酰化反应过程

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题是针对现有的犹他游动放线菌野生菌株ECB去酰化酶产量低，对ECB的生物转化效率不高的不足，提供一种ECB去酰化酶产量较高，转化ECB效率更高的犹他游动放线菌基因工程菌及其制备方法。

阿尼芬净制备的工艺路线中，ECB去酰化即其母核的制备是关键步骤。因此，本发明人将该去酰化酶基因，作为外源基因插入ECB去酰化酶产生菌犹他游动放线菌的基因组中，并使它高效表达，发现得到的犹他游动放线菌突变株的ECB转化效率大大提高，可见ECB去酰化酶基因的插入，增加了ECB去酰化酶基因的拷贝数并上调了该酶的表达量，从而提高了转化ECB的效率，从而完成了本发明。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种高效转化棘白菌素B的基因工程菌，其是在犹他游动放线菌Actinoplanes utahensis野生菌株的基因组中整合有棘白菌素B去酰化酶基因的表达盒的工程菌。

在基因组中整合入外源基因的表达盒，从而使插入的外源基因表达是现有技术，一般是让该外源基因用启动子转录，终止子终止转录即可。本发明中所述的棘白菌素B去酰化酶基因的表达盒较佳的依次包括启动子、棘白菌素B去酰化酶基因编码区和终止子。启动子可以启动基因的转录，从而使基因表达。强启动子的启动效率更高。因此，本发明中，所述的启动子可以采用现有技术中任何可以在犹他游动放线菌中启动转录的启动子，优选犹他游动放线菌的自身启动子，较佳的如序列表中SEQ ID NO.1的第1～430位所示的序列。也可以为红霉素抗性基因启动子。本发明中所述的棘白菌素B去酰化酶基因较佳的来源于犹他游动放线菌Actinoplanes utahensis，其编码序列优选序列表中SEQ ID NO.1第431～2794位所示的序列。所述的终止子为本领域常规的终止子，较佳的如序列表中SEQ ID NO.1的第2795～3998位所示的序列。