[发明专利]一种高效转化棘白菌素B的基因工程菌及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，特别涉及一种高效转化棘白菌素B的基因工程菌及其制备方法。

背景技术

在过去的二十多年里，严重危害人类生命健康的真菌感染，无论是其发生频率还是感染种类都在不断地增加，特别是在免疫抑制患者中。在20世纪80年代中期前的近30年里，两性霉素一直是控制临床真菌感染的主要药物，尽管其神经毒性比较大，但临床别无选择。直到20世纪80年代末和90年代咪唑类及三唑类抗真菌药物的研发成功，临床方能有效而安全地控制真菌感染。但是，随着这些抗真菌药物的使用，耐药菌不断出现，因此，寻找一种新的安全有效的抗真菌药物就显得尤为重要。

棘白菌素类药物是20世纪70年代发现的一组天然产物，是真菌的次级代谢产物，包含一个带有一条脂类侧链的环状六肽核，该脂类侧链通过非竞争性作用机制抑制β-(1，3)-D-葡聚糖的合成，从而导致细胞壁葡聚糖的排空、渗透不稳定以及真菌细胞的溶解而发挥其抗真菌作用。棘白菌素作为一种可杀死真菌的药物表现出抗菌谱广、活性强的特点，是治疗免疫抑制患者和免疫正常患者真菌感染的重要选择药物。但是天然的棘白菌素类化合物由于酰基侧链的存在，使其具有一定的溶血毒性。将棘白菌素B切除侧链之后，经过一系列的化学修饰可以得到一系列具有临床应用前景的衍生物。其中最主要的是如西洛芬净(Cilofungin)、卡帕芬净(Caspofungin，MK991)、米卡芬净(Micafungin，FK463)、阿尼芬净(Anidulafungin，LY303366)。西洛芬净由于其毒性和剂型(不溶于水)问题以及对卡氏肺囊虫肺炎(PCP)的活性较低，目前已经终止了研究开发，但后三者已先后在01年、02年、06年上市。

其中阿尼芬净是由礼来公司和Vicuron Pharmaceuticals公司联合研制开发，给药途径为静脉滴注。动物实验研究表明，同卡泊芬净和米卡芬净相比，阿尼芬净对烟曲霉菌活性更强，对白色念珠菌活性相对较弱。在一项对食管念珠菌感染患者进行的双盲对照试验中，静脉滴注阿尼芬净的有效率为97.2％，氟康唑的有效率为98.8％，阿尼芬净的不良反应发生率为10％，对照组为13％。阿尼芬净的制备过程经过两步：(1)通过微生物转化-游动放线菌发酵产生的去酰化酶对棘白菌素B进行催化，使侧链断裂，生成母核和不饱和脂肪酸侧链。(2)在母核的基础上加入新的侧链——戊氧-三苯羧基。但是游动放线菌生长周期长，发酵条件较为苛刻，并且游动放线菌野生菌株去酰化酶产量不高，因此目前通过游动放线菌转化棘白菌素B的效率低，生产成本较高。

棘白菌素B(ECB)去酰化反应过程

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题是针对现有的棘白菌素B去酰化酶产生菌如游动放线菌生长周期长以及转化棘白菌素B效率低的不足，提供一种生长周期更短、转化棘白菌素B的效率更高的基因工程菌及其制备方法。

变铅青链霉菌Streptomyces lividans是一种生长周期短，生长条件比较简单，比较为人们所熟练掌握的真菌，但是不具有转化棘白菌素B的功能。因此，本发明人将棘白菌素B去酰化酶基因，作为外源基因插入变铅青链霉菌Streptomyces lividans的基因组中，并使它高效表达，发现得到的变铅青链霉菌突变株具有较高的棘白菌素B转化效率，从而完成了本发明。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种高效转化棘白菌素B的基因工程菌，其是在变铅青链霉菌Streptomyces lividans野生菌株的基因组中整合有棘白菌素B去酰化酶基因的表达盒的工程菌。

在基因组中整合入外源基因的表达盒，从而使插入的外源基因表达是现有技术，一般是让该外源基因用启动子转录，终止子终止转录即可。本发明中所述的棘白菌素B去酰化酶基因的表达盒较佳的依次包括启动子、棘白菌素B去酰化酶基因编码区和终止子。启动子可以启动基因的转录，从而使基因表达。强启动子的启动效率更高。因此，本发明中所述的启动子可以采用现有技术中任何可以在变铅青链霉菌中启动转录的启动子，优选红霉素抗性基因启动子，其核苷酸序列优选序列表中SEQ ID NO.1所示的序列，也可以是犹他游动放线菌中棘白菌素B去酰化酶基因的自身启动子。所述的棘白菌素B去酰化酶基因较佳的来源于犹他游动放线菌Actinoplanes utahensis，其核苷酸序列优选序列表中SEQ ID NO.2所示的序列。所述的终止子为本领域常规的终止子。