[发明专利]一种运用一步RT-PCR法检测犬瘟热病毒的方法

说明书

技术领域

本发明属病毒检测领域，具体涉及一种运用一步RT-PCR法检测犬瘟热病毒的方法。

背景技术

犬瘟热（Canine distemper）是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus）引起犬的高度接触性、急性传染病。CDV在分类上属副粘病毒科麻疹病毒（MV）属，与麻疹病毒、牛瘟病毒之间有密切的抗原关系和共同特征，并与其超微形态和结构完全一样，而且与新城疫及其他副粘病毒非常相似。犬瘟热病毒是一种传染性极强的病原体，在易感的犬和水貂中很容易传播。病毒存在于肝、脾、肺、肾、脑和淋巴结等多种器官与组织中，通过眼泪、鼻液、唾液、尿液和呼出的空气向外排出病毒。犬瘟热一年四季均可发生，但以冬春多发，本病有一定的周期性，每三年一次大流行，不同年龄、性别和品种的犬均可感染，但以未成年的幼犬最为易感。临床上以双相热、急性鼻卡他、结膜炎及其后出现的支气管炎或肺炎、胃肠炎和神经症状为特征。犬瘟热是当前我国养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业危害最大的疫病之一，经常引起大批犬、貂、狐等动物发病，病死率30%-80%，雪貂高达100%。这不但给毛皮动物养殖场(户)造成了严重的经济损失，且严重地影响和制约整个产业的快速发展。

根据CDV的流行病学资料及临床症状，如双向热、粘膜卡他、中枢神经症状及足垫角化过度等主要症状，可做出初步诊断；而确诊则需要依据实验室检测，如理包涵体检查、病毒分离等，其中检测特异性抗体进行诊断的前提条件是发病动物没有疫苗接种史，这些方法包括琼脂扩散沉淀试验、ELISA和中和试验、荧光抗体技术以及其他免疫组化技术。虽然上述方法取得了一定的效果，但有的耗时较长，有的敏感性、特异性或准确性较差，不能及时确诊。

发明内容

本发明目的在于提供一种运用一步RT-PCR法检测犬瘟热病毒的方法，以解决CDV检测时耗时长、敏感性及特异性差、准确性不高的问题。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案采用一步RT-PCR法检测犬瘟热病毒，针对GeneBank中CDV 的N基因设计一对特异性引物，序列如下：

上游引物CDV 1：5’-GGTCGGAGAATTTAGAATGAAC-3’；

下游引物CDV 2：5’-CCAAGAGCCGGATACATAG-3’。

本方法的具体步骤如下：

1）犬瘟热病毒样品总RNA提取，并测提取后总RNA的浓度； 

2）一步RT-PCR法扩增CDV 的N基因片段；

3）取扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

步骤1）所述的犬瘟热病毒样品总RNA提取，包括以下步骤：

A、分泌物（鼻、眼睛、消化道）、脏器（心、肝、脾、肺、肾、）和脑组织及淋巴结的预处理 ：

①组织样品的预处理：取样品稀释液，（0.01mol/LPBS(pH7.2-7.4)）10×稀释研磨待检脏器及脑组织，取100μl研磨液，置1.5ml离心管中，保存于-20℃待检。

②液体样品（鼻液、眼部结膜分泌物、唾液、尿液）的预处理：用棉签采集的液体样品处理时，将采集棉签倒置于离心管中，加入样品稀释（0.01mol/LPBS(pH7.2-7.4)）4℃静置2h，4℃、2000-3000r/min离心10min，取上清200μl，置1.5ml离心管中，保存于-20℃待检。

B、提取总RNA：

取待检样品200μl于1.5mlEppendorf管中，加入800μlTrizol，充分混匀，静置5min，加入200μl氯仿剧烈震荡30s，4℃、12000r/min离心10min，取水相400-600μl，加入等体积的异丙醇轻轻颠倒混匀，4℃预冷10min后，4℃、10000r/min离心10min，弃去上清，加入600μl75﹪乙醇，4℃、10000r/min离心10min，弃去上清，加入20μlDEPC- H₂O溶解RNA沉淀。

步骤2）所述的一步RT-PCR反应体系为：

 总RNA溶液                                    10.0μl 

dNTPs（2.5mM）                             5.0μl 

10×Taq Buffer                                   5.0μl 

MgCL₂                                                10μl